Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm và nhà lưới của Viện Bảo vệ thực vật ở Đức Thắng, Bắc Từ Liêm, Hà Nội, cùng với các vườn trồng nhãn chín muộn tại huyện Quốc Oai, Hoài Đức và Chương Mỹ thuộc Hà Nội.
Thời gian nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu bắt đầu tháng 09 năm 2018 đến tháng 09 năm 2019.
Đối tượng/vật liệu nghiên cứu
- Các chủng vi sinh vật Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces linacinus ký sinh bọ xít hại nhãn
- Bọ xít hại nhãn vải Tessaratoma papillosa Drury
- Chế phẩm sinh học Beauveria bassiana phòng trừ bọ xít hại nhãn
- Các vườn nhãn chín muộn đang sản xuất đại trà tại huyện Chương Mỹ, Quốc Oai, Hoài Đức tại Hà Nội
- Môi trường dùng trong nghiên cứu: Môi trường PDA
Thành phần: Khoai tây: 300 gram, Agar: 20 gram, Đường dextrose: 20 gram, Nước cất: 1000ml
Để làm môi trường nuôi cấy nấm, bạn cần 300g khoai tây đã gọt vỏ và cắt lát mỏng, sau đó luộc nhừ với một ít nước và lọc qua 4 lớp vải màn để lấy nước trong Tiếp theo, cho nước khoai tây, đường Gluco và agar vào xoong, quấy đều và đun sôi Đổ hỗn hợp vào chai thủy tinh PYREX và hấp khử trùng ở 121°C, 1atm trong 15 phút Sau khi hấp xong, cho môi trường vào hộp, đậy nắp lại, và khi nguội thì cấy nấm vào Nếu không sử dụng ngay, hãy quấn màng chống nhện, cho các hộp vào túi nilon sạch và buộc chặt để bảo quản trong tủ lạnh, sử dụng trong 2-3 ngày sau.
Nồi hấp khử trùng, tủ sấy vô trùng, buồng cấy vô trùng và các thiết bị như tủ lạnh, tủ định ôn, máy lắc, đèn cực tím, kính hiển vi, buồng đếm hồng cầu là những dụng cụ quan trọng trong nghiên cứu và thí nghiệm Ngoài ra, các dụng cụ như poca và nắp đậy, hóa chất các loại, máy cất nước, máy ảnh, cốc thuỷ tinh, ống nghiệm, pipet, đĩa petri, que cấy, bình tam giác, phễu, cối sứ, bông, giấy thấm cũng đóng vai trò thiết yếu Trong các thí nghiệm ngoài đồng, dụng cụ như cọc, bảng, dây nylon, thước dây, lưới và dụng cụ phun thuốc là không thể thiếu.
Nội dung nghiên cứu
Chúng tôi đã thu thập, phân lập và tuyển chọn thành công các chủng vi sinh vật (VSV) có hoạt tính sinh học cao, nhằm phòng chống hiệu quả bọ xít hại nhãn trong giai đoạn chín muộn.
- Thu thập, phân lập các chủng vi sinh vật gây bệnh cho bọ xít từ các vùng trồng nhãn chín muộn tập trung ở Hà Nội
- Đánh giá, tuyển chọn các chủng VSV có hiệu lực cao trong hạn chế bọ xít hại nhãn chín muộn
- Nghiên cứu tạo nguồn chủng thuần và kỹ thuật bảo quản duy trì bộ giống vi sinh vật thuần khiết
Nội dung 2: Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bọ xít hại nhãn chín muộn
Nghiên cứu xác định điều kiện sinh trưởng, phát triển sinh khối thích hợp nhất đối với các chủng VSV đã lựa chọn
Nội dung 3: Nghiên cứu kỹ thuật sử dụng chế phẩm để phòng chống bọ xít hại nhãn chín muộn
- Khảo nghiệm, đánh giá hiệu quả phòng trừ bọ xít hại nhãn của chế phẩm trong phòng thí nghiệm, nhà lưới, ngoài đồng ruộng (diện hẹp)
- Nghiên cứu phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học: nghiên cứu liều lượng, thời điểm, số lần phun thích hợp.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Thu thập, phân lập và tuyển chọn bộ giống vi sinh vật (VSV) ký sinh bọ xít hại nhãn
3.5.1.1 Phương pháp thu thập các vi sinh vật gây bệnh cho bọ xít Điều tra thu thập các nguồn vi sinh vật ký sinh gây chết bọ xít ngoài tự nhiên tại 3 khu vực trồng nhãn chín muộn tập trung của Hà Nội Đó là các vùng ven sông Đáy trực thuộc các huyện Hoài Đức, Quốc Oai, Chương Mỹ và các vùng lân cận Mỗi khu vực chọn 3 vườn đại diện được tính đa dạng của sản xuất của khu vực đó Tại mỗi vườn chọn 5 điểm, mỗi điểm chọn cây có mật độ bọ xít cao, thu bắt các thể bọ xít chết Xác định các mẫu bọ xít bị nấm ký sinh bằng phương pháp quan sát ban đầu theo triệu chứng của vi sinh vật ký sinh côn trùng như: Bề mặt có lớp bào tử, côn trùng ký chủ bị triệu chứng chết cứng… Mẫu vật thu thập được bảo quản riêng trong các ống túyp có nút bông đã được khử trùng sau đó đem về phòng thí nghiệm để phân lập và giám định mẫu
3.5.1.2 Phương pháp phân lập các chủng VSV ký sinh trên bọ xít
Phân lập nấm theo phương pháp của Barnett và Hunter (1972) bắt đầu bằng việc khử trùng mẫu bọ xít bằng dung dịch cồn 50% trong 30 giây Sau đó, mẫu được nghiền trong cối sứ và thêm 1 đến 5 ml nước vô trùng Tiếp theo, sử dụng micro pipet để hút 0,1 ml dung dịch và cho vào đĩa môi trường PDA, sau đó dùng trang thủy tinh để trang kín bề mặt.
3.5.1.3 Phương pháp tuyển chọn và đánh giá chủng nấm có hiệu lực cao trong phòng trừ bọ xít hại nhãn
Tại Trung tâm Đấu tranh sinh học (Viện Bảo vệ thực vật), việc đánh giá và tuyển chọn các chủng nấm có hiệu lực cao trong việc phòng trừ bọ xít đã được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm Phương pháp áp dụng là phun trực tiếp dung dịch bào tử nấm lên cá thể bọ xít tuổi 2, nhằm xác định khả năng kiểm soát và tiêu diệt loài này.
Thí nghiệm được thực hiện với 8 công thức tương ứng với 8 chủng nấm lây nhiễm vào bọ xít non, bao gồm BX1, BX2, BX3, BX4, BX5, BX6, BX7, BX8, cùng với một công thức đối chứng (phun nước lã) Mỗi công thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lây nhiễm trên 30 cá thể bọ xít tuổi 2, được đặt trong môi trường pocan Nồng độ bảo tử nấm lây nhiễm được sử dụng là 5,0×10^9 Cfu/ml.
- Chỉ tiêu theo dõi: số bọ xít chết sau 7, 10 ngày lây nhiễm nấm
- Hiệu lực ký sinh gây chết bọ xít của các chủng nấm được tính theo công thức Abbott
3.5.1.4 Giám định chủng VSV có hoạt tính sinh học cao trong phòng chống hiệu quả bọ xít hại nhãn
Chủng vi sinh vật có tiềm năng được xác định thông qua việc phân tích đặc điểm hình thái của nấm, kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử và giải trình tự gen vùng ITS.
Giám định bằng hình thái là quá trình xác định loài nấm sau khi nuôi cấy trên môi trường PDA trong 5 ngày Sau thời gian này, các mẫu cành bào tử được lấy ra và soi trên kính hiển vi để thực hiện việc giám định chính xác.
- Giám định bằng kỹ thuật sinh học phân tử:
Lấy 1 vũng que cấy khuẩn ty vào ống eppendorf vụ trựng, thờm 500 àl 2×SSC vào mỗi ống Lắc đều và giữ ở 99 o C trong 10 phút Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 1 lần bằng nước cất vụ trựng Thờm khoảng 100 àl hạt thủy tinh cú đường kớnh 0,2 - 0,5 mm (Roth, Đức), 100 àl dung dịch phenol/chloroform (tỉ lệ 1:1) và 100 àl nước cất vô trùng Lắc ở 1400 vòng/phút trong 10 phút trên máy Thermocomfort (Eppendorf, Đức) sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút Lấy phần dịch trong phía trên có chứa ADN làm khuôn cho phản ứng PCR ADN sau khi tách chiết được giữ ở -20 o C Định tên vi sinh vật bằng giải trình tự
Phân đoạn rADN vi sinh vật được khuyếch đại sử dụng mồi ITS1 và NL4 trên thiết bị GeneAmp® PCRSystem 9700 (PE Applied Biosystem, Mỹ) Chương trình nhiệt được thiết lập với pha biến tính ở 94 o C trong 2 phút.
35 chu kỳ nhiệt (94 o C trong 30 giây, 52 o C trong 30 giây và 72 o C trong 1 phút) Quá trình khuyếch đại được hoàn tất ở 72 o C trong 7 phút và sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở 10 o C
The PCR product was purified using QIAEX II (Qiagen, Germany) as per the manufacturer's recommendations DNA sequencing was performed via the "dideoxy chain termination" method with the AmpliTaq kit (Amersham) following the provided guidelines The sequencing was conducted using the Applied Biosystems model 377 sequencer DNA sequences were compared to GeneBank using the BLAST nucleotide-nucleotide search interface at the National Center for Biotechnology Information in Bethesda, USA Related sequences were downloaded, processed with BioEdit software (Hall, 1999), and aligned using ClustalX (Thompson et al., 1997).
Danh sách các mồi sử dụng trong phân loại
3.5.1.5 Phương pháp nghiên cứu tạo nguồn chủng thuần và kỹ thuật bảo quản duy trì bộ giống vi sinh vật thuần khiết
Phương pháp tạo nguồn chủng thuần bao gồm việc pha loãng chủng vi sinh vật với nước cất vô trùng ở nồng độ từ 10^3 đến 10^5 Sử dụng pipetman và đầu típ vô trùng, chuyển 0,1 ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri có chứa môi trường PDA Để khử trùng, nhúng chang thủy tinh vào cồn 70 độ và hơ qua ngọn lửa, sau đó để nguội trong không gian vô trùng Mở đĩa petri và nhẹ nhàng đặt chang thủy tinh lên bề mặt thạch, sau đó sử dụng đầu chang gạt xoay để trải đều dịch giống lên bề mặt thạch.
Trong quá trình trải, xoay đĩa khoảng 1/2 chu vi để phân bố chang thủy tinh đều trên bề mặt môi trường Sau đó, rút chang thủy tinh, đậy đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ấm Sau 12 - 24 giờ, soi đĩa nấm bằng kính lúp để quan sát bào tử nảy mầm Khi bào tử nảy mầm, dùng que cấy có đầu nhọn để cắt phần thạch chứa bào tử và cấy sang đĩa môi trường khác Để đĩa chứa đơn bào tử trong điều kiện phòng thí nghiệm, sau 3-5 ngày, bào tử sẽ phát triển thành tản nấm, từ đó tiến hành cấy truyền vào tuýp môi trường để thu được chủng vi sinh vật thuần khiết.
Phương pháp bảo quản các chủng giống gốc:
Cấy các chủng giống nấm vào ống môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ 25 o C trong 7 ngày để kích thích sự hình thành bào tử Mỗi công thức sẽ được cấy 100 ống cho từng chủng nấm Sau đó, tiến hành bảo quản các chủng nấm bằng ba phương pháp khác nhau tương ứng với ba công thức đã sử dụng.
CT1: Bảo quản ống thạch nghiêng bằng phương pháp thông thường: Các ống giống sẽ được đặt trong điều kiện tủ lạnh 4 o C
CT2: Bảo quản bằng ống thạch nghiêng + glyceryl: Đổ dung dịch glyceryl 5% ngập hết bề mặt của ống giống nấm đã cấy, sau đó đặt trong điều kiện 4 o C
CT3: Bảo quản bằng phương pháp bào tử nấm + Glycerol 10% bảo quản ở điều kiện -20 o C
Sau thời gian bảo quản, 3 tháng 1 lần lấy giống ra và pha loãng ở nồng độ
10 -5 và cấy lại trên môi trường, sau 5 ngày đếm số bào tử mọc mầm
Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử nấm nảy mầm
Phương pháp đếm bào tử sử dụng buồng đếm hồng cầu, bắt đầu bằng cách nghiền 1 cm² tản nấm vào 10 ml nước cất và lắc đều Sau đó, lấy 1 ml dịch bào tử đã pha và cho vào 9 ml nước cất, tiếp tục hòa theo tỷ lệ 1 ml dịch bào tử với 9 ml nước cất để tiến hành đếm.
9 ml nước cất cho đến khi đếm được bào tử (10 -4 – 10 -6 )
3.5.2 Phương pháp nghiên cứu xác định điều kiện sinh trưởng, phát triển sinh khối thích hợp nhất đối với nấm Beauveria bassiana BX1
3.5.2.1 Thí nghiệm xác định thành phần môi trường thích hợp
Thí nghiệm nhằm xác định thành phần môi trường tối ưu cho việc nhân sinh khối nấm B bassiana đã được thực hiện với 4 công thức tương ứng với 4 loại môi trường có thành phần cơ chất khác nhau.
MT1 : Bột ngô mảnh 80gram + bã đậu phụ 20gram
Công thức MT2 bao gồm 60 gram cám gạo, 30 gram bột ngô mảnh và 10 gram bã bia khô Công thức MT3 sử dụng 60 gram cám gạo, 30 gram bột ngô mảnh và 10 gram bột đậu nành Cuối cùng, công thức MT4 yêu cầu 200 gram gạo hấp chín và 30 ml dung dịch CaCO3 0,5%.
Xử lý số liệu
- Số liệu điều tra ngoài đồng ruộng được tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel 2010
- Số liệu thu thập từ thí nghiệm được xử lý thống kê sinh học theo chương trình IRRISTAT 5.0
- Mật độ bọ xít (con/cành) được tính theo công thức:
Mật độ bọ xít = Tổng số bọ xít điều tra
Tổng số cành điều tra
Hiệu quả của chế phẩm được xác định dựa trên công thức Abbott cho thí nghiệm trong phòng và nhà lưới, cùng với công thức Henderson-Tilton cho thí nghiệm ngoài đồng.
Trong đó: K(%): Hiệu lực của thuốc
C: Tỷ lệ % sâu sống ở công thức đối chứng T: Tỷ lệ % sâu sống ở công thức thí nghiệm + Công thức Henderson- tilton
Trong đó: K(%): Hiệu lực của thuốc
Ta: Mật độ sâu ở công thức thí nghiệm sau phun thuốc
Ca: Mật độ sâu ở công thức đối chứng sau phun thuốc
Tb: Mật độ sâu ở công thức thí nghiệm trước phun thuốc
Cb: Mật độ sâu ở công thức đối chứng trước phun thuốc
