Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Chủng virus KTY-PRRS-06 được phân lập tại ổ dịch ở Hải Phòng năm
2015 và lưu trữ tại phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Chủng virus KTY-PRRS-06 đã được phân lập từ mẫu bệnh phẩm của lợn mắc PRRS tại phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y, thuộc Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
* Dụng cụ, máy móc, thiết bị
- Chai nuôi cấy tế bào, khay 24 giếng, khay 96 giếng, pipet
- Tủ ấm 37 0 C/ 5% CO2, nồi hấp, tủ sấy, tủ lạnh các loại: -4 0 C, -20 0 C, -80 0 C, bình nitơ lỏng, kính hiển vi soi nổi, máy chụp ảnh tế bào
- Sử dụng buồng cấy vô trùng, máy ly tâm lạnh, máy spin, vortex, máy lắc ấm, máy PCR,
The Beckman Coulter CEQ 8000 automated sequencer from the USA is equipped with essential data processing software, including CEQ 8000 (version 9.0), Genetyx (version 5.0.4), and MEGA5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 5.10).
- Tế bào Marc-145 được nuôi cấy trong bình nuôi (T25 hoặc T75) và trên khay 24 giếng
- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: Môi trường nuôi cấy DMEM, FCS, khỏng sinh (Penicillin (100 U/àl), Streptomycin (100 àg/ml), EDTA, Trypsin, DMSO),…
- Các chất dùng để tách chiết RNA của virus: Trizol (1ml Trizol/2ml hỗn dịch), PCS, Chloroform, Iso-propy alcohol, Ethanol 70%
- Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Mồi xuôi, mồi ngược, enzyme…
- Bộ môn Bệnh lý Thú y - Khoa Thú y - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam
- Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y - Khoa Thú Y - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
Từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 6 năm 2016.
N ội dung nghiên cứu
3.2.1 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145
- Hồ sơ giống virus KTY-PRRS-06 lựa chọn nghiên cứu
- Khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển
- Hiệu giá virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển
3.2.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY- PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145
- Giải trình tự gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06;
- So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY- PRRS-06 qua các đời cấy chuyển
- So sánh trình tự axit amin của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY- PRRS-06 qua các đời cấy chuyển
- Xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ di truyền của chủng virus KTY-PRRS-06.
P hương pháp nghiên cứu
3.3.1.Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145
* Chuẩn bị tế bào Marc-145
- Gọi tế bào từ dạng tế bào bảo quản
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường DMEM bổ sung 5% FCS làm ấm trong tủ 37 0 C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy
Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng
Bước 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào
Hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM có bổ sung 5% FCS, sau đó chuyển tế bào vào bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường DMEM + 5% FCS Đảm bảo đóng chặt bình nuôi cấy và ghi rõ tên tế bào cùng ngày gọi dậy trên nắp bình.
Để bảo quản hoặc cấy chuyển tế bào, hãy giữ tế bào trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2 Cần theo dõi sự phát triển của tế bào hàng ngày; khi tế bào mọc dày và kín bề mặt đáy bình, đó là thời điểm thích hợp để thu tế bào.
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lượng tế bào lên một lượng nhất định để phục vụ nghiên cứu
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin-EDTA Thêm 7ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm
Bước 3: Loại bỏ Trypsin, đem ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng
Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào bằng cách hòa tan tế bào trong 6ml môi trường đầy đủ Sau đó, tiến hành đếm tế bào và pha loãng tế bào với tỷ lệ 1:100 (10µl tế bào trong 990µl môi trường không đầy đủ) Cuối cùng, sử dụng buồng đếm để xác định số lượng tế bào trên kính hiển vi và tính toán số tế bào trong 1ml.
Bước 5: Cấy chuyển tế bào bằng cách pha loãng tế bào đến nồng độ 2x10^5 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ, sau đó chia huyễn dịch tế bào vào các bình nuôi với thể tích 6ml cho bình T25 và 15ml cho bình T75.
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 37 0 C, 5% CO 2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào
* Gây nhiễm virus KTY-PRRS-06
Khi tế bào Marc-145 đã phủ kín bề mặt giếng nuôi cấy mà không chồng chéo lên nhau, cần hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ và bổ sung 100µl mẫu virus đã chuẩn bị Sau đó, hỗn dịch virus tế bào được ủ ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2 trong 60 phút.
Bổ sung 1,5ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB vào các giếng nuôi và ủ ở 37 0 C với 5% CO2
Hằng ngày, chúng tôi theo dõi sự phát triển của bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi nổi vào các thời điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ sau khi gây nhiễm.
Hằng ngày, chúng tôi theo dõi sự phát triển của bệnh tích tế bào thông qua kính hiển vi soi nổi, chụp ảnh tế bào và thu virus khi chúng tiêu diệt từ 80% đến 90% số tế bào gây nhiễm.
- Chủng virus được bảo quản trong tủ -80°C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo
3.3.2 Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID 50
Tế bào Marc-145 được chuẩn bị trên khay 96 giếng, mỗi giếng chứa 2,0x10^4 tế bào Sau khi hút bỏ dịch môi trường, huyễn dịch chứa bệnh phẩm được ly tâm để loại bỏ cặn, sau đó pha loãng với tỷ lệ 1:10 và ủ trên bề mặt tế bào trong các giếng đã đánh dấu trước (25 µl/giếng), mỗi độ pha loãng được lặp lại 3 lần Sau 1 giờ ủ, dung dịch DMEM có chứa 5% FBS được bổ sung vào các giếng tế bào để gây nhiễm virus (100 µl/giếng).
Bệnh tích tế bào (CPE - Cyto Pathogenic Effect) được theo dõi hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi nhiễm Phương pháp Behrens-Karber được sử dụng để xác định TCID50 (Lan NT và cộng sự, 2005).
3.3.3 Xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy chuyển
Virus PRRS được nhiễm vào tế bào với tỷ lệ MOI là 0,01 Sau 1 giờ ủ, huyễn dịch chứa virus được loại bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch bằng 0,5ml PBS, sau đó bổ sung môi trường DMEM có 10% TPB Virus được thu thập riêng biệt từ ngoài và trong tế bào ở các thời điểm 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 và 108 giờ sau khi nhiễm Đường cong nhân lên của virus được xây dựng dựa trên Log10 của TCID50/25µl tại mỗi thời điểm thu virus.
3.3.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS
RNA tổng số là toàn bộ RNA được tách chiết từ mẫu nghiên cứu, bao gồm RNA của hệ gen virus và các loại RNA cấu trúc, RNA hoạt động (tRNA, mRNA) của tế bào và virus Để thu được RNA, cần loại bỏ DNA, vì sự hiện diện của DNA sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của RT-PCR Mục tiêu là thu nhận RNA của hệ gen virus PRRS với hàm lượng cao, đảm bảo đủ cho việc thực hiện RT-PCR.
Tách chiết RNA virus bằng Kit QIAgen
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kit
Bước 1: Hỳt 560àl Buffer AVL vào ống Eppendorf loại 1,5ml
Để xử lý mẫu bệnh phẩm, cho 140 µl dung dịch mẫu vào ống Eppendorf và thêm dung dịch PCS Sau đó, vortex hỗn dịch trong 15 giây để đảm bảo sự hòa trộn đồng nhất.
Bước 4: Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút
Bước 5: Thờm 560 àl dung dịch Ethanol (96% - 100%) vào ống, vortex 15 giây và Spin down để loại bỏ các giọt trên nắp
Bước 6: Hỳt 630àl huyễn dịch trờn sang cột QIAamp spin (cột lọc) Ly tõm
8.000 vòng/phút, trong 2 phút, giữ cột, loại bỏ dung dịch phía dưới ống
Bước 7: Lặp lại bước 6 một lần nữa với phần mẫu còn lại
Bước 8: Thờm 500àl dung dịch AW1, ly tõm 8.000 vũng/phỳt, trong 2 phỳt rồi giữ cột, bỏ nước dưới
Bước 9: Ly tâm 500ml dung dịch AW2 ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 3 phút, giữ cột và loại bỏ dung dịch phía dưới cột Sau đó, ly tâm thêm một lần nữa ở 14.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dung dịch AW2.
Bước 10: Đặt cột QIA vào ống Eppendorf 1,5ml mới sau đó thêm 60ml dung dịch AVE để ở nhiệt độ phòng 1 phút
Sau đó ly tâm 8.000 vòng, trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa RNA tổng số
Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -20°C hoặc -80°C
* Các bước tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được tiến hành phản ứng RT- PCR theo bộ Kit one-step Invitrogen với các thành phần được trình bày dưới bảng 3.1
Bảng 3.1 Thành phần và thể tích cho phản ứng RT- PCR
Thành phần phản ứng Thể tớch cần lấy(àl)
Các cặp mồi cho phản ứng RT-PCR bao gồm mồi xuôi và mồi ngược, được thiết kế để khuếch đại đoạn gen ORF5 dài 603bp của virus PRRSV, như được thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Các cặp mồi cho phản ứng RT- PCR Trình tự nucleotid của đoạn mồi Kích thước
Mồi xuôi ATG TTG GGG AAG TGC TTG ACC
603 bp Mồi ngược CTA GAG ACG ACC CCA TTG TTC
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT- PCR Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Số chu kỳ
Tổng hợp sợi mới 72 1 phút
Sản phẩm của phản ứng RT-PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di
* Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm
Kỹ thuật điện di được sử dụng trong phân tích định tính, định lượng, thu nhận, tách các acid nucleic và protein từ một hỗn hợp mẫu
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Trong điện di, hai loại thạch phổ biến được sử dụng là Agarose và Polyacrylamid Cả hai loại thạch này được hòa tan trong dung dịch đệm TBE hoặc TAE Nghiên cứu này lựa chọn thạch Agarose kết hợp với dung dịch đệm TAE để tạo ra bản gel.
