Vật liệu và phương pháp
Địa điểm, thời gian nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01/2018 – 05/2019.
Vật liệu nghiên cứu
Mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm Canine Parvovirus được thu nhận tại các phòng khám thú y Hà Nội
Bảng 3.1 Danh sách mẫu CPV thu nhận ở Hà Nội sử dụng trong nghiên cứu giải mã gen
STT Kí hiệu Giống Tuổi Triệu chứng điển hình
VN Fox 3 tháng Tiêu chảy, phân lẫn máu Phân và nước phân
VN Fox 4 tháng Nôn mửa, tiêu chảy
3 HN-VN Becgi e lai 3 tháng Nôn và tiểu ra máu Phân và nước phân
3.2.2 Dụng cụ và thiết bị a Thiết bi ̣
- Tủ lạnh thường; tủ lạnh âm sâu -80 o C (Sanyo, Nhật Bản);
- Máy ly tâm Centrifuge 5415D (Eppendorf, Đức)
- Máy PCR GeneAtlas 322 (Astec, Nhâ ̣t Bản);
- Máy điện di kiểm tra sản phẩm PCR (Bio-Rad, Mỹ);
- Máy soi gel Dolphin-Doc (Wealtech, Mỹ);
- Máy ổn nhiệt (Bio-Rad, Mỹ)
- Máy Votex VM-10 (Daihan, Hàn Quốc)
- Máy vi tı́nh (HP, Mỹ)
- Lò vi sóng (Sam Sung, Hàn Quốc)
Hı̀nh 3.1 Mô ̣t sô trang thiết bi ̣ trong phòng thı́ nghiê ̣m b Dụng cụ
- Bộ pipetman (10àl, 20àl, 100àl, 200àl, 1000àl và 5000 àl)
- Bộ Kit tách chiết GeneJET genomic DNA purification Kit của hãng Thermo (Mỹ)
- Bộ Kit Dream Taq PCR master mix của hãng Thermo (Mỹ)
- Bộ Kit tinh sạch GeneJET PCR purification Kit và GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo (Mỹ)
- Dung di ̣ch Ethidium Bromide
Phương pháp nghiên cứu
Hı̀nh 3.2 Sơ đồ quy trı̀nh thı́ nghiê ̣m 3.3.1 Phương pháp thu nhận mẫu
Mẫu bệnh phẩm được cung cấp bởi phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Các mẫu bệnh phẩm là các tăm bông chứa phân của chó nghi nhiễm Parvovirus được thu thập từ các phòng khám thú y trên địa bàn Hà Nội
Các mẫu đã được chẩn đoán sơ bộ thông qua việc quan sát triệu chứng lâm sàng và kiểm tra bệnh tích Sau đó, các mẫu này được xác định dương tính với virus Parvovirus chó (CPV) bằng bộ kit chẩn đoán nhanh Canine Parvovirus Antigen Test Kit và phương pháp Blot Test (BINOTE) tại phòng khám thú y.
Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -20 0 C
3.3.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Quá trình thu nhận DNA tổng số bao gồm DNA từ nhân tế bào chủ và DNA của virus, thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit tách chiết DNA Để có được DNA tinh sạch, cần loại bỏ các tạp chất, đặc biệt là protein Phương pháp tách chiết dựa trên sự hòa tan khác nhau của nucleic acid và protein trong hai pha không hòa tan, cụ thể là phenol, chloroform và nước.
Phương pháp tiến hành theo thứ tự:
- Phá vỡ màng tế bào, màng nhân
Sau khi tách chiết, DNA tinh sạch được thu thập trong một dung dịch lớn Quá trình ly tâm giúp thu nhận DNA dưới dạng cặn tủa, dễ dàng bảo quản và có thể hòa tan lại trong nước với nồng độ mong muốn khi cần thiết.
Tách chiết DNA tổng số theo hướng dẫn của Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit Các bước cụ thể được thể hiện ở bảng 3.1 như sau:
Bảng 3.2 Quy trình tách chiết DNA tổng số
1 Bổ sung 150 àl H2O vào ống eppendorf chứa tăm bụng cú mẫu bệnh phẩm, vortex nhiều lần, ủ 37 o C qua đêm
2 Bỏ tăm bụng (vắt kiệt nước nhất cú thể), bổ sung 180 àl Digest solution và 20 àl Protease K, vortex
3 Ủ 56 o C, vortex liên tục 10 phút/lần cho đến khi dung dịch đồng nhất
4 Bổ sung 20 àl enzyme RNase A, vortex, để ở nhiệt độ phũng 10 phỳt
5 Bổ sung 200 àl Lysis solution, vortex cho đến khi dung dịch đồng nhất
6 Bổ sung 400 àl Ethanol 50%, vortex
7 Chuyển dịch lên cột lọc, li tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch phía dưới ống hứng
8 Bổ sung 500 àl WB1, li tõm 13.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, bỏ dịch phı́a dưới ống hứng
9 Bổ sung 500 àl WB2, li tõm 13.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, bỏ dịch phía dưới ống hứng
10 Li tâm làm khô ở 13.000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch phía dưới ống hứng
11 Chuyển cột lọc sang ống thu, bổ sung 45 àl EL, để nhiệt độ phũng 2 phút, li tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút
12 Bảo quản DNA ở nhiệt độ -20 o C
Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp khuếch đại một đoạn gen cụ thể bằng cách sử dụng mồi đặc hiệu và enzyme polymerase chịu nhiệt Mồi xuôi (Forward primer) tác động trên mạch DNA 5’ – 3’ và được ký hiệu là F, trong khi mồi ngược (Reverse primer) tác động trên mạch DNA 3’ – 5’ và ký hiệu là R Khi các mồi này kết hợp với sợi DNA bổ sung trong điều kiện thích hợp, chúng sẽ kích hoạt quá trình khuếch đại DNA thông qua phản ứng dây chuyền với sự hỗ trợ của enzyme polymerase.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm ba giai đoạn:
Giai đoạn 1 của quá trình biến tính diễn ra ở nhiệt độ 94 độ C trong 5 phút, tại đây các phân tử DNA mạch kép được tách ra thành các sợi đơn Các sợi đơn này sau đó sẽ được sử dụng làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào, đồng thời enzyme polymerase sẽ xúc tác quá trình tổng hợp.
Giai đoạn 2 của quá trình gắn mồi diễn ra ở nhiệt độ 50 – 65 oC trong khoảng thời gian 1 – 2 phút, tùy thuộc vào từng đoạn mồi cụ thể Mục đích của giai đoạn này là để các đoạn mồi bám chặt vào các trình tự bổ sung tương ứng trên các phân tử DNA khuôn.
- Giai đoạn 3: Tổng hợp 68 – 72 o C trong 30 giây – 2 phút Thời gian kéo dài phụ thuộc vào cả DNA – polymerase và chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại
Quá trình PCR bao gồm 30 – 40 chu kỳ, với chu kỳ cuối duy trì nhiệt độ ở 72 o C trong 5 – 10 phút để các sợi đơn DNA kết hợp thành mạch đôi Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng thạch agarose 0,8 – 1%, và băng DNA sẽ hiện rõ dưới tia cực tím sau khi nhuộm bằng Ethidium Bromide.
Cặp mồi được thiết kế dựa trên sự so sánh trình tự tương đồng chuỗi nucleotide của tất cả các chủng CPV-2 hiện có trong Ngân hàng gen, theo nghiên cứu của Đoàn Thị Thanh Hương và cộng sự năm 2018.
Trình tự của că ̣p mồi như sau:
Mồi xuôi CPVF2b: 5’-TTGGCGTTACTCACAAAGACG- 3’ (vi ̣ trı́ 2160 –
Mồi ngược CPVR4: 5’-GCATTTACATGAAGTCTTGG -3’ (vi ̣ trı́ 5023 –
Că ̣p mồi trên đươ ̣c sử du ̣ng để khuếch đa ̣i vùng gen có kı́ch thước 2,9 kb chứa toàn bô ̣ gen VP2 gồm 1755 nucleotide
Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày trong bảng 3.2 và bảng 3.3:
Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng PCR
Thành phần Thể tớch(àl)
DreamTaq TM PCR Master Mix (2X) 25
Bảng 3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Giai đoa ̣n Nhiệt độ( o C) Thời gian Số chu kì
3.3.4 Phương pháp điện di trên gel Agarose
Phương pháp điện di dựa trên nguyên lý rằng các acid nucleic mang điện tích âm trong môi trường pH trung tính nhờ vào các gốc phosphat trong cấu trúc hóa học Dưới tác dụng của điện trường không đổi, các phân tử di chuyển từ cực âm sang cực dương và dừng lại ở điểm đẳng điển đặc trưng cho từng loại acid nucleic Các phân tử có trọng lượng lớn di chuyển chậm hơn so với các phân tử có trọng lượng nhỏ hơn Sản phẩm điện di được nhận diện thông qua việc nhuộm Ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím.
Trong nghiên cứu di truyền và sinh học phân tử, có hai loại gel chính được sử dụng trong kỹ thuật điện di: gel agarose và gel polyacrylamide Gel agarose thường được áp dụng trong các máy điện di, trong khi gel polyacrylamide được sử dụng để phân tách các phân tử acid nucleic có kích thước nhỏ, đặc biệt trong quy trình giải trình tự DNA.
Chỉ thị phân tử DNA phổ biến là DNA của thực khuẩn thể Lambda, với chiều dài 43kb, được cắt bằng enzyme HindIII thành 8 đoạn có độ dài khác nhau: 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; và 0,125kb Việc sử dụng chỉ thị phân tử DNA giúp xác định chính xác chiều dài đoạn DNA cần nghiên cứu.
3.3.5 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm sau PCR được kiểm tra điện di trên gel agarose 1%, tinh sạch theo hướng dẫn của kit GeneJET PCR Purification (Thermo, Mỹ)
Các bước cụ thể được trình bày ở bảng 3.4 như sau:
Bảng 3.5 Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR
1 Bổ sung dung dịch Binding Buffer vào ống chứa sản phẩm PCR với tỉ lệ
1:1 theo thể tích, trộn đều bằng pipet
2 Chuyển dịch lên cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch trong ống hứng phía dưới
3 Bổ sung dung dịch 700 àl Wash Buffer, ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 1 phút, loại bỏ dịch trong ống hứng phía dưới
4 Ly tâm làm khô 13000 vòng/phút trong 2 phút
Chuyển cột lọc vào ống Eppendorf 1.5ml để thu DNA, sau đó bổ sung 50µl dung dịch Elution Buffer Để ống ở nhiệt độ phòng trong 2 phút, tiếp theo ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút và loại bỏ cột lọc.
3.3.6 Phân tích và xử lý số liệu
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ sinh phẩm GeneJET PCR Purification kit của Thermo (Mỹ) và sau đó được gửi đi giải trình tự trực tiếp tại Macrogen (Hàn Quốc).
Trình tự gen VP2 của các chủng CPV được đăng ký trên Ngân hàng gen và các tạp chí quốc tế đã được sử dụng để so sánh với các chuỗi VP2 trong nghiên cứu này, như thể hiện trong Bảng 3.6, thông qua chương trình GENEDOC2.7 (Nicholas).
Phân tích phả hệ nguồn gốc được thực hiện bằng chương trình MEGA6.06, áp dụng phương pháp “kết nối liền kề” (neighbor-joining, NJ) với hệ số tin cậy đạt 1000 bootstrap, theo nghiên cứu của Tamura et al (2013).
Bảng 3.6 Danh sách các chủng CPV sử du ̣ng trong nghiên cứu
Quốc gia Năm phân lâ ̣p
1 TH1-VN Viê ̣t Nam 2017 Nghiên cứu này
2 TH2-VN Viê ̣t Nam 2017 Nghiên cứu này
3 HN-VN Viê ̣t Nam 2018 Nghiên cứu này
