GIỚI THIỆU MÔN HỌC GIỚI THIỆU KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM
GIỚI THỆU MÔN HỌC KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG
AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM
Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm cung cấp kiến thức về các kỹ thuật cơ bản trong vi sinh vật học, phương pháp định lượng vi sinh vật, khảo sát hình thái và tính chất sinh lý của nhóm vi sinh vật thường gặp trong thực phẩm Bài học cũng bao gồm các phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vi sinh trong thực phẩm và vệ sinh công nghiệp.
Trong bài viết này, chúng tôi sẽ trình bày các nội dung chính liên quan đến môi trường nuôi cấy vi sinh vật, kỹ thuật gieo cấy và phân lập, cũng như các phương pháp định lượng và tách vi sinh vật Bên cạnh đó, chúng tôi cũng sẽ đề cập đến cách quan sát vi sinh vật nói chung Mời thầy và các bạn cùng tham khảo những thông tin hữu ích này.
II Giới thiệu kính hiển vi quang học nền sáng
Kính hiển vi là một công cụ thiết yếu trong phòng thí nghiệm vi sinh, với loại phổ biến nhất là kính hiển vi quang học nền sáng.
Kính hiển vi là thiết bị có nhiều thấu kính và nguồn ánh sáng trắng, giúp phóng đại và chiếu sáng các vật thể nhỏ như vi khuẩn và vi sinh vật mà mắt thường không thể nhìn thấy.
Figure 1: Kính hiển vi quang học nền sáng
III.Các bộ phận chủ yếu và chức năng của kính hiển vi quang học nền sáng
Kính hiển vi được trang bị trên một chân đế chắc chắn và có tay cầm, cho phép người dùng dễ dàng di chuyển kính đến vị trí mong muốn.
Bần chứa tiêu bản được thiết kế với một lỗ tròn ở trung tâm, cho phép ánh sáng từ dưới đi qua và chiếu sáng thấu kính phía trên Để quan sát, tiêu bản cần được đặt lên bàn chứa tiêu bản.
Một đèn chiếu được đặt bên trong chân đế, cho phép ánh sáng xuyên qua tụ Abbe, nơi chứa thấu kính Tụ quang được trang bị cửa sập để điều chỉnh lượng ánh sáng, kèm theo thanh gạt để thực hiện điều này Đặc biệt, tụ quang có thể nâng lên hoặc hạ xuống nhờ núm điều chỉnh; cách tối ưu là giữ tụ quang ở vị trí cao nhất và điều chỉnh lượng ánh sáng bằng cách mở hoặc đóng cửa sập.
Trên bàn chứa tiêu bản, có một ống tròn được trang bị thấu kính phóng đại và tay cầm Dưới ống tròn là một cổ xoay với ba hoặc bốn vật kính, trong khi trên ống tròn là thị kính giúp người dùng quan sát bằng cả hai mắt.
Khi sử dụng, cần vặn nút sơ cấp nhẹ nhàng để điều chỉnh độ cao của bàn chứa tiêu bản Nút thứ cấp sẽ di chuyển bàn một cách chậm rãi, tuy nhiên sự di chuyển này khó có thể nhận thấy bằng mắt thường.
6 Lưu ý chỉ hạ bàn chưa mẫu vật đi xuống khi đưa mắt vào quan sát thị kính để tránh trường hợp vật kín
7 Khi xoay nút thứ cấp quá nhanh thì có thể làm nút bị kẹt cứng, phải thông báo cho giáo viên hướng dẫn
Tổng số lần phóng đại của kính hiển vi phụ thuộc vào loại vật kính và thị kính được sử dụng Khi quan sát qua thị kính, sinh viên sẽ thấy kí hiệu “10X”, biểu thị mức độ phóng đại của kính.
Các vật kính trong kính hiển vi thường có ký hiệu “4X”, “10X”, “40X” và “100X”, tương ứng với độ phóng đại 4, 10, 40 và 100 lần Vật kính có độ phóng đại thấp, như 10X hoặc 16mm, thường được gọi là vật kính low-power Trong khi đó, vật kính high-dry, với độ phóng đại 40X hay 4mm, được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau Khi sử dụng dầu soi kính, dầu sẽ được đặt ở vị trí trung tâm giữa tiêu bản và vật kính để đạt được độ phóng đại tối ưu.
9 Độ dài tiêu cự ( focal length) của một vật kính tỉ lệ với đường kính của vật kính đó
10 Sử dụng một mảnh vải mềm và sạch để lau nhẹ nhàng các thấu kính và phía trên tụ quang khi bị bám bụi
11 Sử dụng một mảnh vải mềm và sạch để lau nhẹ nhàng các thấu kính
III CÁC QUY ĐỊNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT
Người làm việc trong phòng thí nghiệm vi sinh phải mặc trang phục bảo vệ và đeo bảng tên
Sinh viên phải tham gia 100% các buổi thí nghiệm và 100% thời gian trong từng buổi thí nghiệm
Khi sinh viên làm đổ hoặc tràn dung dịch, hoặc làm bể dụng cụ thủy tinh, họ cần phải thông báo ngay cho cán bộ phòng thí nghiệm để được hướng dẫn giải quyết tình huống.
Sinh viên phải nắm vững các thao tác vo trùng
Giảm thiểu sự hình thành khí dung khi thao tác
Rửa tay trước và sau khi thí nghiệm
Không được ăn, uống trong phòng thí nghiệm
Không được nằm trong phòng thí nghiệm Đọc kĩ và làm theo các quy định trong bài thực hành
Vệ sinh bàn,ghế và dụng cụ trước và sau khi thí nghiệm Đổ bỏ rác thái đúng quy trình, đúng nơi quy định
Không ngậm các đồ dùng trong miệng
Trả đầy đủ dụng cụ thí nghiệm sau khi hoàn thành xong bài thí nghiệm
Vệ sing phòng thí nghiệm
2 Các yêu cầu an toàn
Cột tóc, mặc áo blouse bảo hộ, găng tay y tế
Nghiêm cấm dùng miệng hút pipet
3 Trong các tình huống khẩn cấp
Lưu ý các trang bị cấp cứu khi cần
Báo cáo các tình huống khẩn cấp ngay lập tức cho giáo viên huống dẫn Bình tĩnh khi có tình huống khẩn cấp
IV AN TOÀN SINH HỌC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC
1 Các chỉ tiêu để thiết lập các cấp độ về an toàn sinh học
Có bốn mức độ an toàn sinh học được xác định dựa trên các nguy cơ như khả năng lây nhiễm, khả năng gây bệnh, khả năng truyền bệnh và bản chất của công việc đang thực hiện.
An toàn sinh học cấp độ 1 là cấp độ bảo vệ cơ bản, tương tác với các tác nhân không gây bệnh ở người bình thường
An toàn sinh học cấp độ 2 liên quan đến các tác nhân có nguy cơ trung bình, có khả năng gây bệnh cho con người qua nhiều con đường khác nhau, bao gồm đường tiêu hóa, da và màng nhầy.
An toàn sinh học cấp độ 3 liên quan đến các tác nhân gây bệnh có khả năng lây lan qua không khí, gây ra các bệnh nghiêm trọng hoặc có thể dẫn đến tử vong.
NHUỘM BÀO TỬ VI KHUẨN
I Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
- Dung dịch Malachite green bảo hòa (khoảng 7.6%)
Phiến kính hình chữ nhật, dầu soi kính
2 Mẫu cần thực hiện: Thịt thúi
Quan sát và phát hiện bào tử trong tế bào
Phân biệt bào tử và tế bào sinh dưỡng
III Nguyên tắc và cách tiến hành
Để làm cho bào tử dễ dàng bất màu, tế bào cần được xử lý bằng nhiệt và acid Sau đó, tế bào chất của bào tử sẽ được nhuộm bằng thuốc nhuộm hoạt tính mạnh Tiếp theo, màu sắc của tế bào chất sẽ được tẩy đi và nhuộm lại bằng thuốc nhuộm phân biệt khác Kết quả là tế bào chất và bào tử sẽ có màu sắc khác nhau, giúp phân biệt chúng dễ dàng hơn.
- Làm vết bôi trên phiến kính
Nhỏ dung dịch A lên vết bôi và hơ nhẹ bên dưới phiến kính để làm bay hơi, tránh để sôi Thêm thuốc nhuộm từ từ để không bị cô cạn, giữ trong 5 phút Sau đó, đợi nguội và đổ thuốc nhuộm đi.
- Dùng dung dịch B rửa lại cho đến khi hết màu đỏ, rửa nước
- Nhuộm lại bằng dung dịch trong 2- 3 phút, rửa nước, thấm khô
- Soi kính: dùng vật kính dầu x100 Bào tử bắt màu đỏ, tế bào bắt màu xanh
Figure 2: Kết quả Nhuộm bào tử
IV Nhận xét và giải thích
Sử dụng tiểu bản phòng ẩm không chỉ giúp tiết kiệm thời gian thực hiện mà còn ngăn ngừa sự phát triển của nấm mốc, đảm bảo môi trường sống luôn sạch sẽ và an toàn.
Quan sát một cách dể dàng các cấu trúc liên quan của nấm mốc bằng các vật kính khác nhau
Dựa vào các cấu trúc sinh sản, đặc điểm hình thái học và sự phát triển của khuẩn lạc, chúng ta có thể xác định và phân loại nấm mốc một cách chính xác.
Trong quá trình cấy mẫu, để lẫn vi sinh vật khác vào làm một số mẫu nấm khó quan sát thậm chí không nhìn thấy gì
Thời gian phải phù hợp nếu để quá dài không xem kết quả sẽ dẫn đến việc mọc nấm trở nên dày đặt khó quan sát
3 Nhận xét và giải thích
Kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm quan sát được có hình dạng sợi và tương tự như Penicillium, thuộc lớp nấm bất toàn.
Deuteromycetes, không có hình thức sinh sản hữu tính Hệ sợi có vách ngăn
Bào tử vô tính là bào tử trần.
KỸ THUẬT TUYỆT TRÙNG BẰNG AUTOCLAVE TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ ( BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA)
I.Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
- Đĩa petri, giấy báo, bình định mức 1000ml, đèn cồn, pipette
II Pha chế môi trường giá đậu đường
Cân 100g giá đậu ( đã rữa sạch) thêm 1000ml nước Đun sôi 30 phút
Lấy phần dịch trong, thêm nước cho đến khi đủ 1000ml
Bổ sung thêm glucose (5% w/v), pepton (0.1% w/v), 2.2% (w/v) agar
III Kỹ thuật tuyệt trùng bằng AUTOCLAVE
- Đặt mẫu cần tuyệt trùng vào giỏ rồi đặt vào trong nồi hấp và đống chặt van
- Chọn lựa các chức năng: nhiệt độ tuyệt trùng, thời gian tuyệt trùng
- Nhấn start để bắt đầu quá trình tuyệt trùng
Nồi bắt đầu gia nhiệt cho đến khi đạt nhiệt độ tuyệt trùng 121°C trong 15 phút Sau khi hoàn thành thời gian tuyệt trùng, quá trình sấy sẽ bắt đầu.
-Khi kết thúc quá trình sấy, sẽ có âm báo, đèn complete sáng
- Nhấn Emerency để xả áp suất, mở nắp khi đồng hồ báo Zero
IV Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí a Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích
- Đem xà lách bỏ vào túi nilong, thêm nước, tiến hành đem đi đập dập, sau đó lấy phần dịch trong
Để thực hiện quá trình pha loãng mẫu, sử dụng pipet vô trùng để chuyển 1 ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng, sau đó trộn đều Dung dịch thu được có độ pha loãng 10^-1 Tiếp tục thực hiện các bước tương tự để đạt được độ pha loãng 10^-2 và 10^-3.
Vi khuẩn hiếu khí là loại vi khuẩn phát triển và tạo thành khuẩn lạc khi có mặt của oxy phân tử Sự hiện diện của chúng trong mẫu là chỉ số quan trọng để đánh giá mức độ vệ sinh của thực phẩm.
Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí là yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng mẫu vi sinh vật, xác định nguy cơ hư hỏng và thời hạn bảo quản sản phẩm, cũng như mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản.
Dùng bút lông dầu ghi chú lên đĩa petri (tên mẫu, Giảng viên hướng dẫn, tên nhóm, độ pha loãng)
Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml mẫu pha loãng vào giữa đĩa petri Tương ứng với mỗi độ pha loãng thực hiện 3 đĩa
Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 – 15 ml môi trường M1 đã được đun chảy và ổn định ở 45 - 50°C
Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần ngay sau khi đổ môi trường
Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang và để yên cho môi trường đông đặc hoàn toàn
Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong 24 - 48 giờ (24 giờ lấy kết quả sơ bộ, 48 giờ lấy kết quả chính thức) ở trên, phần nắp nằm bên dưới)
SỐ KHUẨN LẠC TRÊN ĐĨA Độ pha loãng 1:10 1:100 1:1000
Số khuẩn lạc( CFU) trên đĩa 27,23,11 20,19,23 17,18,16
Giá trị APC (aerobic plate count) được tính như sau:
Kết quả thí nghiệm cho thấy mật độ vi khuẩn giảm dần theo độ pha loãng từ 10^-1 đến 10^-3, với giá trị cuối cùng là 7,096 CFU/ml Tuy nhiên, do có sự cố trong quá trình thao tác, dẫn đến nhiễm khuẩn từ bên ngoài, nên kết quả khuẩn lạc thu được không hoàn toàn chính xác.
Khi tiến hành trải đĩa chưa trải đều đĩa nếu không nấm sẽ mọc san sát nhau rất khó quan sát và đếm chính xác
Dùng phương pháp trải đĩa để thực hiện đếm tổng số nấm men nấm mốc, phương pháp này không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp
Việc đếm lạc khuẩn thuận tiện và chính xác hơn khi có máy hổ trợ đếm lạc khuẩn.
- NẤM MỐC BẰNG THIẾT BỊ LẤY MẪU TRONG KHÔNG KHÍ)
I Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
2 Môi trường và mẫu thưc hiện:
Môi trường M5 (Potato dextrose agar)
200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ
Mẫu thực hiện: xà lách
Tổng số nấm men và nấm sợi là chỉ tiêu vi sinh quan trọng trong thực phẩm, giúp đánh giá tình hình vệ sinh sản phẩm và dự đoán thời gian bảo quản hiệu quả (Lê Văn Việt Mẫn, 2006)
III Nguyên tắc và cách tiến hành
Trong kỹ thuật này, một thể tích nhỏ huyền phù vi sinh vật được pha loãng và chuyển vào trung tâm bề mặt đĩa thạch, sau đó được trải đều trên bề mặt môi trường bằng que cấy gạt đã được vô trùng Que cấy gạt được vô trùng bằng cách nhúng vào 95% ethanol và sau đó đốt cháy Sau một thời gian, vi khuẩn sẽ phát triển thành những khuẩn lạc riêng lẻ.
1) Ghi nhãn ở đáy đĩa petri
2) Dùng pippet chuyển 0.1ml huyền phù vi sinh vật vào giữa đĩa petri chưa môi trường PDA
3) Nhúng que cấy gạt vào cốc thủy tinh chứa 95% ethanol, gõ nhẹ que cấy vào thành cốc
4) Đốt que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn và để nguội que cấy bên dưới nắp đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy
5) Trãi đều huyền phù vi sinh vật khắp bề mặt môi trường không chạm que cấy vào thành đãi petri và không đặt nắp hộp petri xuống mặt bàn
6) Nhúng que cấy gạt vào cốc thủy tinh chưa 95% ethanol và đốt que cấy
7) Lặp lại quy trình này với các đĩa petri khác
8) Lật sấp đĩa petri vad ủ ở 30 độ C trong 24-48 giờ
9) Quan sát hình thái của khuẩn lạc và ghi nhận lại
(File video đính kèm: MÔI TRƯỜNG M5)
(File video đính kèm: NẤM MEN, NẤM MỐC.mp4)
IV Kết quả thí nghiệm
Hình: Mật độ vi sinh vật pha loãng ở nồng độ 10 -1
Hình: Mật độ vi sinh vật pha loãng ở nồng độ 10 -2
Hình: Mật độ vi sinh vật pha loãng ở nồng độ 10 -3
Bảng 1: Số lạc khuẫn trên đĩa Độ pha loãng 1:10 1:100 1:1000
Số khuẩn lạc(CFU) trên đĩa
Giá trị APC (aerobic plate count) được tính như sau:
V Nhận xét và giải thích kết quả
Dùng phương pháp trải đĩa để thực hiện đếm tổng số nấm men nấm mốc, phương pháp này không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp
Việc đếm lạc khuẩn thuận tiện và chính xác hơn khi có máy hổ trợ đếm lạc khuẩn
Việc chuẩn bị môi trường và pha loãng mẫu tốn nhiều thời gian
Pha loãng mẫu cần độ chính xác cao
Người tiến hành thao tác chậm không chuẩn xác dẫn đến nhiễm khuẩn từ bên ngoài vào
Khi tiến hành trải đĩa phải trải đều đĩa nếu không nấm sẽ mọc san sát nhau rất khó quan sát và đếm chính xác
3 Nhận xét và giải thích
Theo độ pha loãng giảm dần từ 10 -1 đến 10 -3 mật độ vi khuẩn giảm dần nên kết quả thu được khuẩn lạc cũng giảm dần.
PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG LSB, BGBL
I.Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
II Pha chế môi trường a Chuẩn bị môi trường LSB
Dùng 35.6g hỗn hợp pha sẵn để chuẩn bị thành 1000ml môi trường Tiệt trùng 121oC trong 15 phút b Chuẩn bị môi trường BGBL
Dùng 40g hỗn hợp pha sẵn để chuẩn bị thành 1000ml môi trường Tiệt trùng 121oC trong 15 phút
III ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN a.Nguyên tắc
Coliforms là nhóm vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong vòng 48 giờ khi ủ ở nhiệt độ 37°C trong môi trường lỏng Lauryl Sulfate và Brilliant Green Lactose Bile Salt.
Coliforms là nhóm vi sinh vật phổ biến trong tự nhiên, cũng như trong ruột của người và động vật Chúng được coi là chỉ thị quan trọng, với số lượng coliforms có mặt trong thực phẩm, nước hoặc môi trường khác, giúp xác định khả năng tồn tại của các vi sinh vật gây bệnh khác.
Phương pháp MPN (Most Probable Number) hay còn gọi là phương pháp pha loãng tới hạn, là một kỹ thuật dùng để xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu bằng cách ước lượng số lượng vi sinh vật có xác suất cao nhất trong một đơn vị thể tích Phương pháp này thường được áp dụng trong nghiên cứu vi sinh vật để đánh giá mức độ ô nhiễm hoặc sự hiện diện của vi sinh vật trong các mẫu khác nhau.
Cho vào ống nghiệm môi trường thích hợp cho vi sinh vật cần định lượng, sau đó thêm một thể tích chính xác dung dịch mẫu với ba nồng độ pha loãng bậc 10 (10^1, 10^2, 10^3) Ủ ống nghiệm ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, theo dõi sự tăng trưởng của vi sinh vật qua các biểu hiện như sinh hơi, đổi màu, hoặc đục Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng và sử dụng số liệu này để phân tích dựa trên bảng kết quả.
Mac Crady đưa ra phương pháp xác định mật độ vi sinh vật dưới dạng số MPN/ml hoặc MPN/1 g mẫu, cho phép đo lường số lượng vi sinh vật trong mỗi mililit hoặc trong mỗi gram mẫu.
Tiến hành cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10^-1 vào ba ống nghiệm chứa 10 ml môi trường LSB và ống Durham úp ngược Lặp lại quy trình với dịch mẫu đã pha loãng 10^-2 và 10^-3 Ủ các ống nghiệm trong 48 giờ ở 37°C, xác định ống dương tính qua sự xuất hiện bọt khí trong ống Durham và ghi nhận số lượng ống dương tính Để khẳng định kết quả, sử dụng que cấy vòng chuyển dịch mẫu từ các ống LSB dương tính sang các ống chứa môi trường BGBL, tiếp tục ủ ở 37°C trong 48 giờ và ghi nhận số ống dương tính tương ứng với từng độ pha loãng.
Sau khi tiệt trùng môi trường, cần loại bỏ các ống nghiệm có chứa bọt khí trong ống Durham Những ống nghiệm dương tính với Coliforms sẽ xuất hiện ở cả môi trường LSB và BGBL.
- 8 ống theo 3 độ pha loãng của môi trường LBS dương tính
- Sau khi thử nghiệm khẳng định lại với môi trường BGBL thì 8 ống đều dương tính
D10^-1 D10^-2 Ống dương tính với môi trường là LBS Ống dương tính với môi trường LSB
D10^-3 Ống dương tính với độ pha loãng 10^-1,10^-2, 10^-3 trong môi trường BGBL d Nhận xét
Số ống dương tính trong mỗi mẫu pha loãng Độ pha loãng của mẫu Kết quả được chọn
Các ống nghiệm LSB có kết quả dương tính (bọt khí trong ống Durham) chưa chắc chứa vi khuẩn Coliform Để xác nhận sự hiện diện của Coliform, cần cấy chuyền và kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường BGBL, ủ ở 37 độ C trong 48 giờ Nếu ống nghiệm BGBL sau ủ sinh khí và chuyển sang màu vàng, kết quả sẽ là dương tính, xác nhận có Coliform trong môi trường.
Phương pháp MPN (Most Probable Number) là một kỹ thuật hiệu quả để định lượng vi sinh vật trong các mẫu có nồng độ thấp Phương pháp này sử dụng môi trường và điều kiện nuôi cấy phù hợp, cho phép phát hiện sự sinh trưởng của vi sinh vật ngay cả khi mẫu cấy ban đầu chỉ chứa một tế bào.
ỐNG NGHIỆM THẠCH NGHIÊNG + CẤY CHUYỀN (MẪU NẤM MỐC) ỐNG NGHIỆM THẠCH ĐỨNG + CẤY ĐÂM SÂU(MẪU NẤM MỐC)
I Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
Que cấy vòng, que cấy thẳng
2 Môi trường và mẫu thực hiện
Môi trường M5 (Potato dextrose agar)
200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ
Mẫu thực hiện: nấm mốc
Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong mẫu cần nghiên cứu
Nuôi cấy giống vi sinh vật thuần khiết và nhân giống các giống vi sinh vật từ phương pháp cấy ria
III Nguyên tắc và cách tiến hành
Môi trường được tiệt trùng trong autoclve Ống nghiệm chưa môi trường thạch nuôi cấy vi sinh vật là nấm mốc
2.1 Chuẩn bị ống nghiệm thạch nghiêng và ống nghiệm môi trường thạch sâu
Để tạo ống nghiệm thạch nghiêng, trước tiên cần tiệt trùng môi trường trong autoclave Sau đó, môi trường nóng chảy được lấy ra và đặt trên bề mặt phẳng, với phần đầu ống nghiệm cao hơn đáy, sao cho môi trường bên trong chiếm 2/3 chiều cao ống nghiệm Cuối cùng, để môi trường đông đặc hoàn toàn, cần giữ ống nghiệm ở vị trí thẳng đứng.
ống thạch nghiêng sâu được chuẩn bị tương tự ống nghiệm thạch nghiêng nhưng môi trường được đông cứng và để nguội ở trạng thái thẳng đứng
2.2 Cấy chuyền và cấy đâm sâu
Cấy chuyền ở ống nghiệm thạch nghiêng
Sử dụng que cấy đã được tiệt trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, chuyển giống vi sinh vật (nấm mốc) từ đĩa petri sang ống nghiệm thạch nghiêng PDA bằng cách cấy ria và vuốt nhẹ dây cấy để tạo đường zic-zac trên bề mặt môi trường thạch nghiêng.
Để đảm bảo vô trùng, hãy lấy que cấy ra khỏi ống nghiệm mà không để que chạm vào thành và miệng ống nghiệm Sau đó, tiến hành hơ ống nghiệm dưới ngọn lửa của đèn cồn.
3) Đậy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiêm lên giá đỡ, ủ ở nhiệt độ phù hợp trong 24-48 giờ Sau đó kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật
Cấy đâm sau ở ống thạch đứng
1) Dùng que cấy thẳng đã vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, chuyển giống vi sinh vật (nấm mốc) từ đĩa petri sang ống nghiệm thạch đứng PDA
2) Cấy nấm mốc vào ống nghiệm bằng cách đâm thẳng đứng vào chính giữa môi trường (2/3 chiều sâu của môi trường)
Để đảm bảo vô trùng, hãy lấy que cấy ra khỏi ống nghiệm mà không chạm vào thành và miệng ống nghiệm Sau đó, sử dụng ngọn lửa đèn cồn để hơ ống nghiệm.
Đậy kín miệng ống nghiệm và đặt ống lên giá đỡ, ủ ở nhiệt độ thích hợp trong khoảng 24-48 giờ Sau thời gian này, tiến hành kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật bằng cách tạo một đường đục theo vết cấy đã đâm sâu.
(File đính kèm: THẠCH NGHIÊNG, THẠCH ĐỨNG.)
Hình: Môi trường thạch nghiêng nấm mốc
Hình: Môi trường thạch đứng nấm mốc
IV Nhận xét và giải thích
Việc phân lập giống vi sinh vật thuần khiết và bảo quản chúng trong thời gian dài là rất quan trọng Kỹ thuật bảo quản hiệu quả giúp giảm thiểu tần suất cấy chuyền vi sinh vật, từ đó duy trì chất lượng và tính ổn định của giống vi sinh vật.
Cấy cần thực hiện một cách chính xác và nhanh chóng để giảm thiểu nguy cơ nhiễm vi sinh vật Đối với ống thạch đứng, que cấy vòng cần được cấy sâu khoảng 2/3 chiều sâu của môi trường để đảm bảo hiệu quả.
3 Nhận xét và giải thích kết quả
Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện ở điều kiện vô trùng để tránh các vi sinh vật tạp nhiễm không mong muốn từ môi trường ngoài
Môi trường và dụng cụ nuôi cấy cần được tiệt trùng hoàn toàn để đảm bảo an toàn Trong ống thạch đứng, vi khuẩn kị khí phát triển ở đáy cột môi trường, trong khi ở ống thạch nghiêng, vi sinh vật hiếu khí tạo ra vệt nổi màu trắng đục hoặc trong trên bề mặt thạch.
NHUỘM ĐƠN TIÊU BẢN GIỌT ÉP
I Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
- Phiến kính hình vuông, phiến kính hình chữ nhật
- Kính hiển vi, dầu soi
II Tiêu bản giọt ép a.Nguyên tắc
Vi khuẩn không di động thường thể hiện chuyển động hỗn loạn trong môi trường lỏng, được gọi là chuyển động Brown Tuy nhiên, một số vi khuẩn có khả năng di chuyển thật sự nhờ vào các cơ chế tự thân khác nhau.
Tiêu bản giọt treo (hanging drop slide) là phương pháp hiệu quả để quan sát các kiểu di động và không di động của vi khuẩn Phương pháp này cho phép người dùng nhìn thấy hình dạng vi khuẩn trong trạng thái sống, cũng như cách sắp xếp của các tế bào vi khuẩn khi chúng kết hợp với nhau.
-Dùng que cấy vòng chuyển một ít dung dịch mẫu vi khuẩn lên phiến kính hình chữ nhật
- Dùng phiến kính hình vuông nhẹ nhàng đặt đè lên giọt nước chứa vi khuẩn Tránh không để hình thành bọt khí
-Đặt lên kính hiển vi để quan sát với vật kính dầu c Kết quả
Tiêu bản giọt ép nhìn qua kính hiển vi quang học d Nhận Xét
Nấm mốc có dạng hình que, hình cầu
Có sự chuyển động Brown
Dưới kính hiển vi, chúng ta có thể quan sát hình dạng, kích thước, sự sắp xếp và chuyển động của vi khuẩn thông qua phương pháp làm tiêu bản giọt ép.
-Có thể quan sát được trạng thái sống của tế bào vi khuẩn đặc biệt là sự chuyển động của chúng.Thao tác đơn giản, tiến hành nhanh
Việc xác định hình thái vi khuẩn vẫn còn gặp khó khăn do thao tác thực hiện có thể tạo ra bọt khí khi hai phiến kính được đặt chồng lên nhau, điều này gây trở ngại cho quá trình quan sát Hơn nữa, việc phân biệt giữa chuyển động Brown và chuyển động tự thân cũng dễ bị nhầm lẫn.
III Nhuộm đơn a.Nguyên tắc
Vi khuẩn có kích thước rất nhỏ và số lượng chất trong tế bào cũng vậy, khiến chúng gần như trong suốt ngay cả khi được phóng đại Để dễ dàng quan sát, cần cố định chúng lại và ngăn không cho di động Một phương pháp đơn giản là tạo vết bôi vi khuẩn lên phiến kính thủy tinh, sau đó cố định và nhuộm chúng bằng phẩm nhuộm.
Phẩm nhuộm vi khuẩn tốt nhất là loại aniline, được chiết xuất từ nhựa than đá, giúp làm nổi bật đường nét của vi khuẩn khi sử dụng trực tiếp Các phẩm nhuộm này có thể ở dạng acid, basic hoặc trung tính, trong đó phẩm nhuộm acid và trung tính thường được sử dụng trong nghiên cứu vi khuẩn Các ion âm trong phẩm nhuộm acid kết hợp với cation của tế bào để tạo thành muối, trong khi phẩm nhuộm basic kết hợp với acid trong vật liệu nhuộm Do tế bào vi khuẩn chứa nhiều ribonucleic acid, phẩm nhuộm trung tính cho kết quả nhuộm tốt, thường kết hợp cả hai loại phẩm nhuộm Phẩm nhuộm trung tính rất hiệu quả trong việc làm nổi bật cấu trúc bên trong của vi khuẩn, với các tế bào nhuộm bằng phẩm cơ bản được gọi là basophilic và các tế bào nhuộm bằng phẩm acid được gọi là acidophilic.
-Lắc kỹ dung dịch vi khuẩn Với thao tác vô trùng chuyển 1 hoặc hai vũng cấy vi khuẩn vào giữa phiến kớnh Trải đều trờn diện tớch khoảng ẵ inch
- Hơ phiến kính trên ngọn lửa để cố định và giết chết vi khuẩn
-Nhuộm với phẩm nhuộm crystal violet trong 20 - 30 giây)
-Rửa trôi thuốc nhuộm bằng nước trong vài giây
-Thấm khô bằng giấy thấm Không được xát lên vết
- Quan sát bằng kính hiển vi với vật kính dầu
Nhuộm Gram với mẫu là nấm men d Nhận Xét
Hầu hết vi khuẩn quan sát được có hình dạng que và một số ít có hình dạng que đơn Kết quả này đạt được nhờ kỹ thuật nhuộm đơn, tạo ra sự tương phản rõ ràng giữa vi khuẩn và nền, giúp việc quan sát trở nên dễ dàng hơn.
Có thể cố định vi khuẩn trên phiến kính thủy tinh, giúp chúng gắn chặt vào bề mặt mà không bị biến dạng tế bào Phương pháp này không chỉ giữ nguyên hình dạng vi khuẩn mà còn tiêu diệt chúng một cách hiệu quả.
Kỹ thuật nhuộm vi khuẩn bằng thuốc nhuộm crystal violet tạo ra sự tương phản rõ rệt giữa vi khuẩn và nền, giúp quan sát dễ dàng hơn Phương pháp này có thời gian thực hiện ngắn và cho kết quả nhanh chóng.
- Tuy nhiên, đòi hỏi độ chính xác về thời gian trong quy trình nhuộm đơn
Để chuẩn bị vết bôi hiệu quả, cần sử dụng một lượng vi khuẩn vừa phải Nếu mật độ vi khuẩn quá cao sẽ dẫn đến tình trạng chồng chéo, trong khi nếu quá ít sẽ gây khó khăn trong việc quan sát.
KỸ THUẬT NHUỘM GRAM
II Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
Phiến kính hình chữ nhật, dầu soi kính
2 Mẫu cần thực hiện: Nước dưa cải chua
Phân chia vi khuẩn thành hai nhóm khác nhau: vi khuẩn Gram dương (+) và vi khuẩn Gram âm (-)
IV Nguyên tắc và cách tiến hành
Tiêu bản đầu tiên được nhuộm bằng phẩm nhuộm cơ bản crystal violet, sau đó xử lý với dung dịch iodine để cản màu Tiếp theo, tiêu bản được tẩy màu bằng ethanol và cuối cùng nhuộm bổ sung bằng safranin, một phẩm nhuộm cơ bản có màu khác Kết quả là vi khuẩn Gram dương sẽ có màu tím, trong khi vi khuẩn Gram âm sẽ có màu hồng.
1) Chuẩn bị vết bôi và cố định vi sinh vật
2) Dùng dung dịch crytal violet phủ lên vết bôi Để yên trong 1 phút
3) Để nghiêng phiến kính 45 độ, rửa dưới vòi nước cho trôi hết phần thuốc nhuộm dư (giọt cuối cùng chảy ra khỏi phiến kính không còn màu)
4) Phủ lên vết bôi dung dịch iodine Để yên 1 phút
Để nghiêng phiến kính 45 độ, cần tẩy màu bằng dung dịch 95% ethenol cho đến khi giọt cuối cùng chảy ra không còn màu, thường mất khoảng 10-20 giây Đây là bước quan trọng nhất trong quy trình.
6) Ngay lập tức rửa phiến kính dưới vòi nước
7) Phủ lên vết bôi dung dịch safranin O Để yên 1 phút
9) Thấm nhẹ bằng giấy thấm Hơ khô phiến kính trước khi quan sát dưới kính hiển vi
10) Sử dụng dầu soi kính và vật kính dầu để quan sát Chụp ảnh tiêu bản
(File video đính kèm: NHUỘM GRAM.)
Hình: Kết quả thu được khi nhuộm gram Hình: Kết quả thu được khi nhuộm gram
IV Nhận xét và giải thích
1 Ưu điểm của kỹ thuật nhuộm Gram
Cho kết quả nhanh hơn phương pháp cấy
Phân loại được vi khuẩn Gram âm và Gram dương
2 Nhược điểm của kỹ thuật nhuộm Gram
Nhuộm đơn nhiều lần bằng các loại thuốc nhuộm khác nhau đòi hỏi sự chính xác về thời gian để tránh làm biến đổi vi khuẩn Gram dương thành vi khuẩn Gram âm.
3 Nhận xét và giải thích kết quả
Kết quả thu được vi khuẩn Gram dương bắt màu tím và vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng
Vách tế bào của vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng hơn và chứa nhiều lipid, khiến chúng dễ bị hòa tan trong các chất tẩy màu như cồn và acetone Điều này dẫn đến việc thuốc nhuộm crystal violet ban đầu bị rửa trôi, cho phép vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng từ thuốc nhuộm bổ sung safranin Ngược lại, vi khuẩn Gram dương giữ lại phức chất tím tinh thể - iốt do cồn làm co lại các lỗ trong lớp peptidoglycan.
TIÊU BẢN PHÒNG ẨM
I Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
1 Dụng cụ a) Nước cất b) Đĩa petri c) 95% ethanol d) Đèn cồn e) Que cấy vòng f) Pipette các loại g) Phiến kính hình chữ nhật, phiến kính hình vuông h) dung dịch methylen blue
2 Môi trường và mẫu thưc hiện:
Môi trường M5 (Potato dextrose agar)
200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ
Mẫu thực hiện: nấm mốc
Cấu trúc hình thái của nấm mốc có thể được quan sát mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của chúng Phương pháp này cho phép dễ dàng nhận diện các cấu trúc liên quan đến sinh sản Việc định danh nấm mốc thường dựa vào các đặc điểm hình thái học và sự phát triển của khuẩn lạc (Sơn, 2018)
III Nguyên tắc và cách tiến hành
Môi trường có nồng độ đường cao và pH thấp (5.6) không thuận lợi cho sự phát triển của hầu hết vi khuẩn, giúp hạn chế tạp nhiễm Tuy nhiên, nấm mốc lại phát triển tốt ở pH này Để quan sát khuẩn lạc nấm mốc, có thể lấy một ít sinh khối đặt trên phiến kính với giọt nước hoặc thuốc nhuộm Một phương pháp khác là tiêu bản phòng ẩm, cho phép quan sát cấu trúc hình thái đặc trưng mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc.
- Chuẩn bị các phiến kính hình chữ nhật (glass slide) và phiến kính hình vuông (coverslips) Ngâm phiến kính trong ethanol 80% trong tối thiểu 15 phút
- Hơ bề mặt của các phiến kính này trên ngọn lửa để vô trùng (dùng kẹp để cầm)
- Đun chảy ống nghiệm chứa môi trường Sabouraund dextrose agar hay
Potato dextrose agar, sau đó làm nguội đến 48 – 50oC Đổ môi trường vào trong đĩa petri
- Để đĩa nguội sau đó dùng dao cắt một ô vuông khoảng ô kính hình vuông
- Cho miếng thạch đã cắt vào giữa phiến kính hình chữ nhật và đặt phiến kính hình vuông lên
Để tiến hành thí nghiệm, hãy cho một ít giấy thấm nước vô trùng vào đĩa petri Tiếp theo, đặt một vài que tăm lên trên giấy thấm Sau đó, đặt các phiến kính đã chuẩn bị lên trên các que tăm Cuối cùng, ủ tất cả ở nhiệt độ phòng trong khoảng 2 đến 4 ngày.
Dưới kính hiển vi, việc sử dụng dung dịch methylen blue (0.3% trong ethanol) giúp quan sát rõ hơn cấu trúc của nấm mốc Cồn trong dung dịch này làm mềm vách tế bào nấm mốc, tạo điều kiện thuận lợi cho thuốc nhuộm thấm vào tế bào dễ dàng hơn.
Figure: Kết quả tiêu bản phòng ẩm
IV Nhận xét và giải thích
Sử dụng tiểu bản phòng ẩm không chỉ giúp tiết kiệm thời gian thực hiện mà còn bảo vệ sự phát triển của nấm mốc, đảm bảo môi trường sống luôn sạch sẽ và an toàn.
Quan sát một cách dể dàng các cấu trúc liên quan của nấm mốc bằng các vật kính khác nhau
Dựa vào các cấu trúc sinh sản, đặc điểm hình thái học và sự phát triển của khuẩn lạc, chúng ta có thể xác định và phân loại nấm mốc một cách hiệu quả.
Trong quá trình cấy mẫu, để lẫn vi sinh vật khác vào làm một số mẫu nấm khó quan sát thậm chí không nhìn thấy gì
Thời gian phải phù hợp nếu để quá dài không xem kết quả sẽ dẫn đến việc mọc nấm trở nên dày đặt khó quan sát
3 Nhận xét và giải thích
Kết quả cho thấy nấm quan sát được có dạng sợi, và hình dạng này tương tự với Penicillium thuộc lớp nấm bất toàn, theo tài liệu đã được nghiên cứu.
Deuteromycetes, không có hình thức sinh sản hữu tính Hệ sợi có vách ngăn
Bào tử vô tính là bào tử trần
Thí nghiệm Vi sinh Thực Phẩm không chỉ là môn học thực hành về vi sinh vật mà còn mang lại những bài học kinh nghiệm quý giá Môn học này cung cấp kiến thức về sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm, an toàn trong môi trường làm việc và cách quan sát vi khuẩn Qua các bài học, sinh viên sẽ không ngừng tiến bộ, củng cố kiến thức và nâng cao kỹ năng thao tác một cách đáng kể.
