BÁO cáo THÍ NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM PHA CHẾ môi TRƯỜNG GIÁ đậu ĐƯỜNG kỹ THUẬT TUYỆT TRÙNG BẰNG AUTOCLAVE TỔNG VI SINH vật HIẾU KHÍ ( BẰNG PHƯƠNG PHÁP đổ đĩa)

GIỚI THIỆU MÔN HỌC GIỚI THIỆU KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM

GIỚI THỆU MÔN HỌC KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG

AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM

Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm cung cấp cho người học kiến thức về các kỹ thuật cơ bản trong vi sinh vật học, phương pháp định lượng vi sinh vật, khảo sát hình thái và tính chất sinh lý của vi sinh vật thường gặp trong thực phẩm, cũng như các phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vi sinh và vệ sinh công nghiệp.

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu vi sinh học Kỹ thuật gieo cấy và phân lập vi sinh vật giúp xác định và tách biệt các loài vi sinh vật khác nhau Định lượng và tách vi sinh vật cho phép chúng ta đo lường sự phát triển của chúng trong môi trường nuôi cấy Cuối cùng, việc quan sát vi sinh vật giúp hiểu rõ hơn về đặc điểm và hành vi của chúng Mời thầy và các bạn cùng tham khảo những nội dung này để nâng cao kiến thức về vi sinh vật.

II Giới thiệu kính hiển vi quang học nền sáng

Kính hiển vi là một dụng cụ thiết yếu trong phòng thí nghiệm vi sinh, với loại phổ biến nhất là kính hiển vi quang học nền sáng.

Kính hiển vi này sử dụng nhiều thấu kính và nguồn ánh sáng trắng để phóng đại và chiếu sáng các vật thể nhỏ như vi khuẩn và vi sinh vật mà mắt thường không thể nhìn thấy.

Figure 1: Kính hiển vi quang học nền sáng

III.Các bộ phận chủ yếu và chức năng của kính hiển vi quang học nền sáng

Kính hiển vi được lắp đặt trên một chân đế vững chắc, đi kèm với bộ phận tay cầm giúp dễ dàng di chuyển kính đến vị trí khác.

Bần chứa tiêu bản có lỗ tròn ở trung tâm, cho phép ánh sáng từ dưới đi xuyên qua và chiếu sáng thấu kính phía trên Tiêu bản cần quan sát được đặt trên bàn chứa tiêu bản để thực hiện việc quan sát.

Một đèn chiếu được đặt bên trong chân đế, cho phép ánh sáng đi xuyên qua tụ Abbe, nơi có chứa thấu kính Tụ quang được trang bị cửa sập để điều chỉnh lượng ánh sáng, kèm theo một thanh gạt để dễ dàng điều chỉnh Ngoài ra, tụ quang có thể nâng lên hoặc hạ xuống nhờ núm điều chỉnh; tốt nhất là giữ tụ quang ở vị trí cao nhất và chỉ điều chỉnh lượng ánh sáng bằng cách mở hoặc đóng cửa sập.

Trên bàn chứa tiêu bản, có một ống tròn với các thấu kính phóng đại được gắn với tay cầm Dưới ống tròn là một cổ xoay có từ ba đến bốn vật kính Thị kính nằm trên ống tròn cho phép người dùng quan sát bằng cả hai mắt.

Khi sử dụng thiết bị, hãy vặn nút sơ cấp một cách nhẹ nhàng để điều chỉnh độ cao của bàn chứa tiêu bản Nút thứ cấp sẽ di chuyển bàn chứa tiêu bản một cách chậm rãi, tuy nhiên, sự di chuyển này khó có thể quan sát bằng mắt.

6 Lưu ý chỉ hạ bàn chưa mẫu vật đi xuống khi đưa mắt vào quan sát thị kính để tránh trường hợp vật kín

7 Khi xoay nút thứ cấp quá nhanh thì có thể làm nút bị kẹt cứng, phải thông báo cho giáo viên hướng dẫn

Số lần phóng đại của kính hiển vi phụ thuộc vào loại vật kính và thị kính được sử dụng Khi nhìn qua thị kính, sinh viên sẽ thấy ký hiệu “10X”, cho biết mức độ phóng đại của kính.

Khi sử dụng kính hiển vi, các vật kính có ký hiệu "4X", "10X", "40X" và "100X" thể hiện độ phóng đại tương ứng là 4, 10, 40 và 100 lần Vật kính có độ phóng đại thấp thường được gọi là 10X hoặc 16mm, trong khi vật kính có độ phóng đại cao còn được biết đến với tên gọi 40X hoặc 4mm Đối với kỹ thuật soi dầu, dầu sẽ được đặt ở vị trí trung tâm giữa tiêu bản và vật kính để tối ưu hóa hình ảnh quan sát.

9 Độ dài tiêu cự ( focal length) của một vật kính tỉ lệ với đường kính của vật kính đó

10 Sử dụng một mảnh vải mềm và sạch để lau nhẹ nhàng các thấu kính và phía trên tụ quang khi bị bám bụi

11 Sử dụng một mảnh vải mềm và sạch để lau nhẹ nhàng các thấu kính

III CÁC QUY ĐỊNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT

Người làm việc trong phòng thí nghiệm vi sinh phải mặc trang phục bảo vệ và đeo bảng tên

Sinh viên phải tham gia 100% các buổi thí nghiệm và 100% thời gian trong từng buổi thí nghiệm

Khi xảy ra sự cố đổ tràn dung dịch hoặc làm bể dụng cụ thủy tinh, sinh viên cần phải thông báo ngay cho cán bộ phòng thí nghiệm và yêu cầu hướng dẫn cách xử lý kịp thời.

Sinh viên phải nắm vững các thao tác vo trùng

Giảm thiểu sự hình thành khí dung khi thao tác

Rửa tay trước và sau khi thí nghiệm

Không được ăn, uống trong phòng thí nghiệm

Không được nằm trong phòng thí nghiệm Đọc kĩ và làm theo các quy định trong bài thực hành

Vệ sinh bàn,ghế và dụng cụ trước và sau khi thí nghiệm Đổ bỏ rác thái đúng quy trình, đúng nơi quy định

Không ngậm các đồ dùng trong miệng

Trả đầy đủ dụng cụ thí nghiệm sau khi hoàn thành xong bài thí nghiệm

Vệ sing phòng thí nghiệm

2 Các yêu cầu an toàn

Cột tóc, mặc áo blouse bảo hộ, găng tay y tế

Nghiêm cấm dùng miệng hút pipet

3 Trong các tình huống khẩn cấp

Lưu ý các trang bị cấp cứu khi cần

Báo cáo các tình huống khẩn cấp ngay lập tức cho giáo viên huống dẫn Bình tĩnh khi có tình huống khẩn cấp

IV AN TOÀN SINH HỌC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC

1 Các chỉ tiêu để thiết lập các cấp độ về an toàn sinh học

Có bốn mức độ an toàn sinh học được thiết lập dựa trên các nguy cơ, bao gồm khả năng lây nhiễm, khả năng gây bệnh, khả năng truyền bệnh và bản chất công việc đang được thực hiện.

An toàn sinh học cấp độ 1 là cấp độ bảo vệ cơ bản, tương tác với các tác nhân không gây bệnh ở người bình thường

An toàn sinh học cấp độ 2 liên quan đến các tác nhân có nguy cơ trung bình, có khả năng gây bệnh cho con người qua nhiều con đường khác nhau, bao gồm đường tiêu hóa, da và màng nhầy.

An toàn sinh học cấp độ 3 liên quan đến các tác nhân gây bệnh có khả năng lây lan qua không khí, gây ra các bệnh nguy hiểm hoặc có thể dẫn đến tử vong.

NHUỘM BÀO TỬ VI KHUẨN

I Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện

- Dung dịch Malachite green bảo hòa (khoảng 7.6%)

 Phiến kính hình chữ nhật, dầu soi kính

2 Mẫu cần thực hiện: Thịt thúi

Quan sát và phát hiện bào tử trong tế bào

Phân biệt bào tử và tế bào sinh dưỡng

III Nguyên tắc và cách tiến hành

Tế bào cần được xử lý nhiệt và acid để làm cho bào tử dễ dàng mất màu Sau đó, tế bào chất của bào tử được nhuộm bằng thuốc nhuộm hoạt tính mạnh, sau đó tẩy màu tế bào chất và nhuộm lại bằng thuốc nhuộm khác Kết quả là tế bào chất và bào tử sẽ có màu sắc khác nhau, giúp phân biệt rõ ràng giữa chúng.

- Làm vết bôi trên phiến kính

Nhỏ dung dịch A lên vết bôi và hơ nhẹ dưới phiến kính để làm bay hơi mà không để sôi Thêm thuốc nhuộm từ từ để tránh tình trạng cô cạn, giữ nguyên trong 5 phút Sau khi nguội, đổ thuốc nhuộm đi.

- Dùng dung dịch B rửa lại cho đến khi hết màu đỏ, rửa nước

- Nhuộm lại bằng dung dịch trong 2- 3 phút, rửa nước, thấm khô

- Soi kính: dùng vật kính dầu x100 Bào tử bắt màu đỏ, tế bào bắt màu xanh

Figure 2: Kết quả Nhuộm bào tử

IV Nhận xét và giải thích

Việc áp dụng tiểu bản phòng ẩm không chỉ giúp tiết kiệm thời gian thực hiện mà còn bảo vệ sự phát triển của nấm mốc.

Quan sát một cách dể dàng các cấu trúc liên quan của nấm mốc bằng các vật kính khác nhau

Dựa vào các cấu trúc sinh sản, đặc điểm hình thái học và sự phát triển của khuẩn lạc, chúng ta có thể xác định được loại nấm mốc.

Trong quá trình cấy mẫu, để lẫn vi sinh vật khác vào làm một số mẫu nấm khó quan sát thậm chí không nhìn thấy gì

Thời gian phải phù hợp nếu để quá dài không xem kết quả sẽ dẫn đến việc mọc nấm trở nên dày đặt khó quan sát

3 Nhận xét và giải thích

Kết quả cho thấy nấm quan sát được có dạng sợi và hình dạng thu được tương tự như Penicillium, thuộc lớp nấm bất toàn.

Deuteromycetes, không có hình thức sinh sản hữu tính Hệ sợi có vách ngăn

Bào tử vô tính là bào tử trần

KỸ THUẬT TUYỆT TRÙNG BẰNG AUTOCLAVE TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ ( BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA)

I.Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện

- Đĩa petri, giấy báo, bình định mức 1000ml, đèn cồn, pipette

II Pha chế môi trường giá đậu đường

 Cân 100g giá đậu ( đã rữa sạch) thêm 1000ml nước Đun sôi 30 phút

 Lấy phần dịch trong, thêm nước cho đến khi đủ 1000ml

 Bổ sung thêm glucose (5% w/v), pepton (0.1% w/v), 2.2% (w/v) agar

III Kỹ thuật tuyệt trùng bằng AUTOCLAVE

- Đặt mẫu cần tuyệt trùng vào giỏ rồi đặt vào trong nồi hấp và đống chặt van

- Chọn lựa các chức năng: nhiệt độ tuyệt trùng, thời gian tuyệt trùng

- Nhấn start để bắt đầu quá trình tuyệt trùng

Nồi bắt đầu gia nhiệt cho đến khi đạt nhiệt độ tuyệt trùng 121°C trong 15 phút Sau khi hoàn tất quá trình tiệt trùng, thời gian sấy sẽ bắt đầu ngay lập tức.

-Khi kết thúc quá trình sấy, sẽ có âm báo, đèn complete sáng

- Nhấn Emerency để xả áp suất, mở nắp khi đồng hồ báo Zero

IV Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí a Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích

- Đem xà lách bỏ vào túi nilong, thêm nước, tiến hành đem đi đập dập, sau đó lấy phần dịch trong

Mẫu được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách sử dụng pipet vô trùng để chuyển 1 ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng, sau đó trộn kỹ để đạt được độ pha loãng 10^-1 Tiếp tục thực hiện các bước tương tự để đạt được độ pha loãng 10^-2 và 10^-3 Nguyên tắc này đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy trong quá trình phân tích mẫu.

Vi khuẩn hiếu khí là loại vi khuẩn phát triển và hình thành khuẩn lạc khi có mặt của oxy phân tử Số lượng vi khuẩn hiếu khí có mặt trong mẫu thực phẩm là chỉ số quan trọng để đánh giá mức độ vệ sinh của thực phẩm.

Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí là yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng mẫu vi sinh vật, xác định nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản sản phẩm, cũng như mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản.

 Dùng bút lông dầu ghi chú lên đĩa petri (tên mẫu, Giảng viên hướng dẫn, tên nhóm, độ pha loãng)

 Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml mẫu pha loãng vào giữa đĩa petri Tương ứng với mỗi độ pha loãng thực hiện 3 đĩa

 Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 – 15 ml môi trường M1 đã được đun chảy và ổn định ở 45 - 50°C

 Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần ngay sau khi đổ môi trường

 Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang và để yên cho môi trường đông đặc hoàn toàn

 Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong 24 - 48 giờ (24 giờ lấy kết quả sơ bộ, 48 giờ lấy kết quả chính thức) ở trên, phần nắp nằm bên dưới)

SỐ KHUẨN LẠC TRÊN ĐĨA Độ pha loãng 1:10 1:100 1:1000

Số khuẩn lạc( CFU) trên đĩa 27,23,11 20,19,23 17,18,16

Giá trị APC (aerobic plate count) được tính như sau:

Kết quả thử nghiệm cho thấy mật độ vi khuẩn giảm dần theo độ pha loãng từ 10^-1 đến 10^-3, với giá trị cuối cùng là 7,096 CFU/ml Tuy nhiên, do thao tác không chính xác của người thực hiện, đã dẫn đến hiện tượng nhiễm khuẩn từ bên ngoài.

Khi tiến hành trải đĩa chưa trải đều đĩa nếu không nấm sẽ mọc san sát nhau rất khó quan sát và đếm chính xác

Dùng phương pháp trải đĩa để thực hiện đếm tổng số nấm men nấm mốc, phương pháp này không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp

Việc đếm lạc khuẩn thuận tiện và chính xác hơn khi có máy hổ trợ đếm lạc khuẩn

- NẤM MỐC BẰNG THIẾT BỊ LẤY MẪU TRONG KHÔNG KHÍ)

2 Môi trường và mẫu thưc hiện:

 Môi trường M5 (Potato dextrose agar)

 200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ

 Mẫu thực hiện: xà lách

Tổng số nấm men và nấm sợi là chỉ tiêu vi sinh quan trọng trong thực phẩm, giúp đánh giá tình trạng vệ sinh sản phẩm và dự đoán thời gian bảo quản hiệu quả (Lê Văn Việt Mẫn, 2006).

Trong kỹ thuật này, một thể tích nhỏ huyền phù vi sinh vật được pha loãng và chuyển vào trung tâm bề mặt đĩa thạch Sau đó, nó được trải đều trên bề mặt môi trường bằng que cấy gạt đã được vô trùng bằng cách nhúng vào 95% ethanol và đốt cháy Sau một thời gian, vi khuẩn sẽ phát triển thành những khuẩn lạc riêng biệt.

1) Ghi nhãn ở đáy đĩa petri

2) Dùng pippet chuyển 0.1ml huyền phù vi sinh vật vào giữa đĩa petri chưa môi trường PDA

3) Nhúng que cấy gạt vào cốc thủy tinh chứa 95% ethanol, gõ nhẹ que cấy vào thành cốc

4) Đốt que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn và để nguội que cấy bên dưới nắp đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy

5) Trãi đều huyền phù vi sinh vật khắp bề mặt môi trường không chạm que cấy vào thành đãi petri và không đặt nắp hộp petri xuống mặt bàn

6) Nhúng que cấy gạt vào cốc thủy tinh chưa 95% ethanol và đốt que cấy

7) Lặp lại quy trình này với các đĩa petri khác

8) Lật sấp đĩa petri vad ủ ở 30 độ C trong 24-48 giờ

9) Quan sát hình thái của khuẩn lạc và ghi nhận lại

(File video đính kèm: MÔI TRƯỜNG M5)

(File video đính kèm: NẤM MEN, NẤM MỐC.mp4)

IV Kết quả thí nghiệm

Hình: Mật độ vi sinh vật pha loãng ở nồng độ 10 -1

Bảng 1: Số lạc khuẫn trên đĩa Độ pha loãng 1:10 1:100 1:1000

Số khuẩn lạc(CFU) trên đĩa

Giá trị APC (aerobic plate count) được tính như sau:

V Nhận xét và giải thích kết quả

Dùng phương pháp trải đĩa để thực hiện đếm tổng số nấm men nấm mốc, phương pháp này không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp

Việc đếm lạc khuẩn thuận tiện và chính xác hơn khi có máy hổ trợ đếm lạc khuẩn

Việc chuẩn bị môi trường và pha loãng mẫu tốn nhiều thời gian

Pha loãng mẫu cần độ chính xác cao

Người tiến hành thao tác chậm không chuẩn xác dẫn đến nhiễm khuẩn từ bên ngoài vào

Khi tiến hành trải đĩa phải trải đều đĩa nếu không nấm sẽ mọc san sát nhau rất khó quan sát và đếm chính xác

Theo độ pha loãng giảm dần từ 10 -1 đến 10 -3 mật độ vi khuẩn giảm dần nên kết quả thu được khuẩn lạc cũng giảm dần

PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG LSB, BGBL

I.Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện

II Pha chế môi trường a Chuẩn bị môi trường LSB

Dùng 35.6g hỗn hợp pha sẵn để chuẩn bị thành 1000ml môi trường Tiệt trùng 121oC trong 15 phút b Chuẩn bị môi trường BGBL

Dùng 40g hỗn hợp pha sẵn để chuẩn bị thành 1000ml môi trường Tiệt trùng 121oC trong 15 phút

III ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN a.Nguyên tắc

Coliforms là nhóm vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong vòng 48 giờ khi được ủ ở nhiệt độ 37°C trong môi trường lỏng Lauryl Sulfate và Brilliant Green Lactose Bile Salt.

Coliforms là nhóm vi sinh vật phổ biến trong tự nhiên, có mặt trong ruột người và động vật Chúng được coi là chỉ thị quan trọng, vì số lượng coliforms trong thực phẩm, nước hoặc môi trường có thể phản ánh khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác.

Phương pháp MPN, hay còn gọi là phương pháp số có xác suất cao nhất, là một kỹ thuật được sử dụng để đánh giá số lượng vi sinh vật trong một mẫu Phương pháp này thường được biết đến với tên gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hoặc phương pháp chuẩn độ MPN giúp xác định số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu.

Cho vào ống nghiệm chứa môi trường phù hợp để vi sinh vật phát triển, thêm một thể tích chính xác của mẫu ở ba nồng độ pha loãng 10 liên tiếp (10^1, 10^2, 10^3) Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, sau đó quan sát các dấu hiệu tăng trưởng như sinh hơi, đổi màu hoặc đục trong từng ống nghiệm Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính ở từng nồng độ pha loãng và sử dụng dữ liệu này để phân tích kết quả dựa trên bảng tham khảo.

Mac Crady đã phát triển phương pháp xác định mật độ vi sinh vật, được thể hiện dưới dạng số MPN/ml hoặc MPN/1 g mẫu, giúp đo lường số lượng vi sinh vật trong một mililit hoặc một gram mẫu.

Cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10^-1 vào 3 ống nghiệm chứa 10 ml môi trường LSB và ống Durham úp ngược Tiến hành tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10^-2 và 10^-3, sau đó ủ ống nghiệm ở 37°C trong 48 giờ Ống dương tính được xác định là ống có sinh khí (bọt khí trong ống Durham) Ghi nhận số ống dương tính và thực hiện thử nghiệm khẳng định bằng cách dùng que cấy vòng chuyển dịch mẫu từ các ống LSB dương tính sang các ống chứa môi trường BGBL, tiếp tục ủ ở 37°C trong 48 giờ Cuối cùng, ghi nhận số ống dương tính ứng với mỗi độ pha loãng.

Sau khi tiệt trùng môi trường, cần loại bỏ các ống nghiệm có chứa bọt khí trong ống Durham Các ống có khả năng hiện diện Coliforms là những ống dương tính ở cả môi trường LSB và BGBL.

- 8 ống theo 3 độ pha loãng của môi trường LBS dương tính

- Sau khi thử nghiệm khẳng định lại với môi trường BGBL thì 8 ống đều dương tính

D10^-1 D10^-2 Ống dương tính với môi trường là LBS

21 Ống dương tính với môi trường LSB

D10^-3 Ống dương tính với độ pha loãng 10^-1,10^-2, 10^-3 trong môi trường BGBL d Nhận xét

Số ống dương tính trong mỗi mẫu pha loãng Độ pha loãng của mẫu Kết quả được chọn

Các ống nghiệm LSB có kết quả dương tính (ống Durham xuất hiện bọt khí) không nhất thiết chứa vi khuẩn Coliform Để xác định sự hiện diện của Coliform, cần tiến hành cấy chuyền và kiểm tra sự sinh trưởng của vi khuẩn trên môi trường BGBL, ủ ở 37 độ C trong 48 giờ Nếu sau thời gian ủ, ống nghiệm BGBL có sinh khí và chuyển sang màu vàng, kết quả sẽ là dương tính, xác nhận sự có mặt của Coliform trong mẫu môi trường.

Phương pháp MPN (Most Probable Number) cho phép định lượng vi sinh vật trong các mẫu có nồng độ thấp Với môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp, phương pháp này giúp phát hiện sự sinh trưởng của vi sinh vật trong các ống nghiệm, ngay cả khi mẫu cấy ban đầu chỉ chứa một tế bào.

ỐNG NGHIỆM THẠCH NGHIÊNG + CẤY CHUYỀN (MẪU NẤM MỐC) ỐNG NGHIỆM THẠCH ĐỨNG + CẤY ĐÂM SÂU(MẪU NẤM MỐC)

 Que cấy vòng, que cấy thẳng

2 Môi trường và mẫu thực hiện

 Mẫu thực hiện: nấm mốc

Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong mẫu cần nghiên cứu

Nuôi cấy giống vi sinh vật thuần khiết và nhân giống các giống vi sinh vật từ phương pháp cấy ria

Môi trường được tiệt trùng trong autoclve Ống nghiệm chưa môi trường thạch nuôi cấy vi sinh vật là nấm mốc

2.1 Chuẩn bị ống nghiệm thạch nghiêng và ống nghiệm môi trường thạch sâu

Để tạo ống nghiệm thạch nghiêng, trước tiên, môi trường cần được tiệt trùng bằng autoclave Sau đó, môi trường nóng chảy được lấy ra và đặt trên một bề mặt phẳng, với phần đầu ống nghiệm được nâng cao hơn đáy, đảm bảo rằng môi trường bên trong chiếm 2/3 chiều cao của ống nghiệm.

24 môi trường đông đặc lại hoàn toàn và bảo quản ống nghiệm ở vị trí thẳng đứng

 ống thạch nghiêng sâu được chuẩn bị tương tự ống nghiệm thạch nghiêng nhưng môi trường được đông cứng và để nguội ở trạng thái thẳng đứng

2.2 Cấy chuyền và cấy đâm sâu

 Cấy chuyền ở ống nghiệm thạch nghiêng

Sử dụng que cấy đã được tiệt trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, chuyển giống vi sinh vật (nấm mốc) từ đĩa petri sang ống nghiệm thạch nghiêng PDA bằng cách cấy ria và vuốt nhẹ dây cấy để tạo đường zic-zac trên bề mặt môi trường thạch nghiêng.

Để đảm bảo vô trùng, hãy lấy que cấy ra khỏi ống nghiệm mà không chạm vào thành và miệng ống Sau đó, tiến hành hơ ống nghiệm dưới ngọn lửa đèn cồn.

3) Đậy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiêm lên giá đỡ, ủ ở nhiệt độ phù hợp trong 24-48 giờ Sau đó kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật

 Cấy đâm sau ở ống thạch đứng

1) Dùng que cấy thẳng đã vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, chuyển giống vi sinh vật (nấm mốc) từ đĩa petri sang ống nghiệm thạch đứng PDA

2) Cấy nấm mốc vào ống nghiệm bằng cách đâm thẳng đứng vào chính giữa môi trường (2/3 chiều sâu của môi trường)

Để đảm bảo vô trùng, hãy lấy que cấy ra khỏi ống nghiệm mà không chạm vào thành và miệng ống nghiệm Tiếp theo, hơ ống nghiệm dưới ngọn lửa đèn cồn.

Đậy kín miệng ống nghiệm và đặt lên giá đỡ, ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 24-48 giờ Sau thời gian ủ, kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật bằng cách tạo đường đục theo vết cấy đã đâm sâu.

(File đính kèm: THẠCH NGHIÊNG, THẠCH ĐỨNG.)

Hình: Môi trường thạch nghiêng nấm mốc

Hình: Môi trường thạch đứng nấm mốc

Việc phân lập giống vi sinh vật thuần khiết và bảo quản chúng lâu dài là rất quan trọng Kỹ thuật bảo quản hiệu quả không chỉ giúp duy trì chất lượng của vi sinh vật mà còn giảm thiểu tần suất cấy chuyền, từ đó đảm bảo tính ổn định và độ tin cậy trong các nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật.

Việc cấy mẫu cần phải được thực hiện một cách chính xác và nhanh chóng, vì thời gian cấy kéo dài sẽ làm tăng nguy cơ nhiễm vi sinh vật Đối với ống thạch đứng, que cấy vòng cần được cấy sâu vào 2/3 chiều sâu của môi trường để đảm bảo hiệu quả.

3 Nhận xét và giải thích kết quả

Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện ở điều kiện vô trùng để tránh các vi sinh vật tạp nhiễm không mong muốn từ môi trường ngoài

Môi trường và dụng cụ nuôi cấy cần được tiệt trùng hoàn toàn để đảm bảo an toàn Đặc biệt, trong ống thạch đứng, vi khuẩn kị khí thường phát triển ở đáy cột môi trường.

26 Đối với môi trường đặc ở ống thạch nghiêng, các vi sinh vật hiếu khí phát triển tạo nên vệt nổi màu trắng đục hoặc trong trên mặt thạch

NHUỘM ĐƠN TIÊU BẢN GIỌT ÉP

- Phiến kính hình vuông, phiến kính hình chữ nhật

- Kính hiển vi, dầu soi

II Tiêu bản giọt ép a.Nguyên tắc

Vi khuẩn không di động thường có chuyển động hỗn loạn trong môi trường lỏng, được gọi là chuyển động Brown Tuy nhiên, một số vi khuẩn có khả năng di chuyển thật sự nhờ vào các cơ chế tự thân khác nhau.

Tiêu bản giọt treo (hanging drop slide) là phương pháp hiệu quả để quan sát các kiểu di động và không di động của vi khuẩn Phương pháp này cho phép nghiên cứu hình dạng vi khuẩn trong trạng thái sống, đồng thời giúp xác định sự sắp xếp của các tế bào vi khuẩn khi chúng kết hợp với nhau.

-Dùng que cấy vòng chuyển một ít dung dịch mẫu vi khuẩn lên phiến kính hình chữ nhật

- Dùng phiến kính hình vuông nhẹ nhàng đặt đè lên giọt nước chứa vi khuẩn Tránh không để hình thành bọt khí

-Đặt lên kính hiển vi để quan sát với vật kính dầu c Kết quả

Tiêu bản giọt ép nhìn qua kính hiển vi quang học

Nấm mốc có dạng hình que, hình cầu

Có sự chuyển động Brown

Phương pháp làm tiêu bản giọt ép cho phép chúng ta quan sát hình dạng, kích thước, sự sắp xếp và chuyển động của vi khuẩn dưới kính hiển vi một cách rõ ràng.

-Có thể quan sát được trạng thái sống của tế bào vi khuẩn đặc biệt là sự chuyển động của chúng.Thao tác đơn giản, tiến hành nhanh

Việc xác định hình thái vi khuẩn vẫn còn gặp khó khăn do dễ hình thành bọt khí khi đặt hai phiến kính chồng lên nhau, điều này ảnh hưởng đến khả năng quan sát Hơn nữa, có thể dễ dàng nhầm lẫn giữa chuyển động Brown và chuyển động tự thân của vi khuẩn.

III Nhuộm đơn a.Nguyên tắc

Kích thước nhỏ bé của vi khuẩn và số lượng chất trong tế bào khiến chúng gần như trong suốt, ngay cả khi đã phóng đại và giảm độ chiếu sáng Để dễ dàng quan sát, cần cố định vi khuẩn để chúng không di động Một trong những phương pháp đơn giản là tạo vết bôi vi khuẩn lên phiến kính thủy tinh, sau đó cố định và nhuộm chúng bằng phẩm nhuộm.

Phẩm nhuộm vi khuẩn tốt nhất là loại aniline, được chiết xuất từ nhựa than đá, giúp làm nổi bật đường nét của vi khuẩn khi áp dụng trực tiếp lên mẫu đã cố định Các loại phẩm nhuộm này bao gồm dạng acid, basic và trung tính, trong đó phẩm nhuộm acid và trung tính thường được sử dụng trong nghiên cứu vi khuẩn Các ion tự do trong phẩm nhuộm acid kết hợp với cation trong tế bào để tạo thành muối, trong khi phẩm nhuộm basic chứa nhiều ion âm kết hợp với acid trong vật liệu nhuộm Do tế bào vi khuẩn có nhiều ribonucleic acid, việc sử dụng phẩm nhuộm này rất hiệu quả trong việc phân tích vi khuẩn.

Phẩm nhuộm dạng trung tính rất hiệu quả trong việc bắt màu, thường kết hợp cả phẩm nhuộm cơ bản và acid Chúng đặc biệt hữu ích cho việc nhuộm các tế bào phức tạp, giúp làm nổi bật cấu trúc bên trong của vi khuẩn Các tế bào và cấu trúc bị nhuộm bằng phẩm nhuộm cơ bản được gọi là basophilic, trong khi những tế bào bị nhuộm với phẩm nhuộm acid được gọi là acidophilic.

-Lắc kỹ dung dịch vi khuẩn Với thao tác vô trùng chuyển 1 hoặc hai vũng cấy vi khuẩn vào giữa phiến kớnh Trải đều trờn diện tớch khoảng ẵ inch

- Hơ phiến kính trên ngọn lửa để cố định và giết chết vi khuẩn

-Nhuộm với phẩm nhuộm crystal violet trong 20 - 30 giây)

-Rửa trôi thuốc nhuộm bằng nước trong vài giây

-Thấm khô bằng giấy thấm Không được xát lên vết

- Quan sát bằng kính hiển vi với vật kính dầu

Nhuộm Gram với mẫu là nấm men d Nhận Xét

Hầu hết các vi khuẩn quan sát được có hình dạng que chuỗi, trong khi một phần nhỏ có hình dạng que đơn Kết quả này đạt được nhờ kỹ thuật nhuộm đơn, tạo ra sự tương phản rõ rệt giữa vi khuẩn và nền, giúp việc quan sát trở nên dễ dàng hơn.

Vi khuẩn có thể được cố định trên phiến kính thủy tinh, giúp chúng gắn chặt mà không bị biến dạng tế bào Quá trình này không chỉ giữ cho vi khuẩn ở vị trí cố định mà còn tiêu diệt chúng hiệu quả.

Kỹ thuật nhuộm vi khuẩn sử dụng thuốc nhuộm crystal violet tạo ra sự tương phản rõ rệt giữa vi khuẩn và nền, giúp quan sát dễ dàng hơn Phương pháp này có thời gian tiến hành ngắn, cho kết quả nhanh chóng.

- Tuy nhiên, đòi hỏi độ chính xác về thời gian trong quy trình nhuộm đơn

Để chuẩn bị vết bôi hiệu quả, cần sử dụng một lượng vi khuẩn vừa phải Nếu mật độ vi khuẩn quá nhiều sẽ gây chồng chéo, trong khi nếu quá ít sẽ làm khó khăn trong việc quan sát.

KỸ THUẬT NHUỘM GRAM

II Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện

 Phiến kính hình chữ nhật, dầu soi kính

2 Mẫu cần thực hiện: Nước dưa cải chua

Phân chia vi khuẩn thành hai nhóm khác nhau: vi khuẩn Gram dương (+) và vi khuẩn Gram âm (-)

IV Nguyên tắc và cách tiến hành

Tiêu bản được nhuộm với phẩm nhuộm cơ bản crystal violet, sau đó xử lý với dung dịch iodine để cản màu Tiếp theo, tiêu bản được tẩy màu bằng ethanol và nhuộm bổ sung với safranin Kết quả cho thấy vi khuẩn Gram dương có màu tím, trong khi vi khuẩn Gram âm có màu hồng.

1) Chuẩn bị vết bôi và cố định vi sinh vật

2) Dùng dung dịch crytal violet phủ lên vết bôi Để yên trong 1 phút

3) Để nghiêng phiến kính 45 độ, rửa dưới vòi nước cho trôi hết phần thuốc nhuộm dư (giọt cuối cùng chảy ra khỏi phiến kính không còn màu)

4) Phủ lên vết bôi dung dịch iodine Để yên 1 phút

Để nghiêng phiến kính 45 độ, cần tẩy màu bằng dung dịch ethenol 95% cho đến khi giọt cuối cùng chảy ra không còn màu, thường mất khoảng 10-20 giây Đây là bước quan trọng nhất trong quy trình.

6) Ngay lập tức rửa phiến kính dưới vòi nước

7) Phủ lên vết bôi dung dịch safranin O Để yên 1 phút

9) Thấm nhẹ bằng giấy thấm Hơ khô phiến kính trước khi quan sát dưới kính hiển vi

10) Sử dụng dầu soi kính và vật kính dầu để quan sát Chụp ảnh tiêu bản

(File video đính kèm: NHUỘM GRAM.)

Hình: Kết quả thu được khi nhuộm gram Hình: Kết quả thu được khi nhuộm gram

1 Ưu điểm của kỹ thuật nhuộm Gram

Cho kết quả nhanh hơn phương pháp cấy

Phân loại được vi khuẩn Gram âm và Gram dương

2 Nhược điểm của kỹ thuật nhuộm Gram

Nhuộm đơn nhiều lần với các loại thuốc nhuộm khác nhau yêu cầu sự chính xác cao về thời gian để đảm bảo không làm biến đổi vi khuẩn Gram dương thành vi khuẩn Gram âm.

3 Nhận xét và giải thích kết quả

Kết quả thu được vi khuẩn Gram dương bắt màu tím và vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng

Vách tế bào của vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng hơn vi khuẩn Gram dương, chứa hàm lượng lipid cao và dễ bị hòa tan trong chất tẩy màu như cồn và acetone Điều này khiến cho thuốc nhuộm ban đầu, crystal violet, dễ bị rửa trôi, cho phép vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng từ thuốc nhuộm bổ sung safranin Ngược lại, ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại, giữ lại phức chất tím tinh thể - iốt trong tế bào.

TIÊU BẢN PHÒNG ẨM

1 Dụng cụ a) Nước cất b) Đĩa petri c) 95% ethanol d) Đèn cồn e) Que cấy vòng f) Pipette các loại g) Phiến kính hình chữ nhật, phiến kính hình vuông h) dung dịch methylen blue

2 Môi trường và mẫu thưc hiện:

 Mẫu thực hiện: nấm mốc

Có thể quan sát cấu trúc hình thái đặc trưng của nấm mốc mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của chúng Phương pháp này cho phép dễ dàng theo dõi và nghiên cứu các đặc điểm của nấm mốc.

Việc xác định nấm mốc chủ yếu dựa vào 35 cấu trúc liên quan đến sự sinh sản, cùng với các đặc điểm hình thái học và sự phát triển của khuẩn lạc (Sơn, 2018).

Môi trường với nồng độ đường cao và pH thấp (5.6) không thuận lợi cho sự phát triển của hầu hết vi khuẩn, giúp hạn chế tạp nhiễm Ngược lại, nấm mốc phát triển tốt ở pH 5.6 Có thể quan sát trực tiếp khuẩn lạc nấm mốc bằng cách lấy sinh khối và đặt lên phiến kính với giọt nước hoặc thuốc nhuộm Một phương pháp khác là tiêu bản phòng ẩm, cho phép quan sát cấu trúc hình thái đặc trưng của nấm mốc mà không làm ảnh hưởng đến sự phát triển của chúng.

- Chuẩn bị các phiến kính hình chữ nhật (glass slide) và phiến kính hình vuông (coverslips) Ngâm phiến kính trong ethanol 80% trong tối thiểu 15 phút

- Hơ bề mặt của các phiến kính này trên ngọn lửa để vô trùng (dùng kẹp để cầm)

- Đun chảy ống nghiệm chứa môi trường Sabouraund dextrose agar hay

Potato dextrose agar, sau đó làm nguội đến 48 – 50oC Đổ môi trường vào trong đĩa petri

- Để đĩa nguội sau đó dùng dao cắt một ô vuông khoảng ô kính hình vuông

- Cho miếng thạch đã cắt vào giữa phiến kính hình chữ nhật và đặt phiến kính hình vuông lên

Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên bạn cần cho một ít giấy thấm nước (vô trùng) vào đĩa petri Sau đó, đặt một vài que tăm lên trên phần giấy thấm Tiếp theo, đặt các phiến kính đã chuẩn bị lên trên các que tăm Cuối cùng, ủ hỗn hợp này ở nhiệt độ phòng trong khoảng 2 – 4 ngày.

Dưới kính hiển vi, việc sử dụng dung dịch methylen blue (0.3% trong ethanol) giúp quan sát cấu trúc của nấm mốc một cách rõ ràng hơn Cồn trong dung dịch này làm mềm vách tế bào nấm mốc, tạo điều kiện thuận lợi cho thuốc nhuộm thẩm thấu vào tế bào dễ dàng hơn.

Figure: Kết quả tiêu bản phòng ẩm

Sử dụng tiểu bản phòng ẩm không chỉ giúp rút ngắn thời gian thực hiện mà còn bảo vệ sự phát triển của nấm mốc, mang lại hiệu quả tối ưu trong việc kiểm soát độ ẩm.