(LUẬN văn THẠC sĩ) khảo sát thành phần hóa học của vỏ thân cây me rừng phyllanthus emblica linn

TỔNG QUAN

Đặc điểm thực vật cây Me rừng

Cây Me rừng, còn được gọi bằng nhiều tên khác nhau tùy theo từng vùng miền tại Việt Nam như mận rừng, me quả tròn, chùm ruột núi, chùm ruột rừng, mác kham (Tày), diều cam (Dao), và xì xà Liên (K’Ho).

Tên khoa học: Phyllanthus emblica Linn

Thuộc họ: Thầu dầu (Euphorbiaceae)

Cây Me rừng là loài thực vật phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới châu Á, đặc biệt tại Việt Nam, Ấn Độ, và Thái Lan Tại Việt Nam, cây Me rừng chủ yếu tập trung ở các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc như Cao Bằng, Lạng Sơn, và Vĩnh Phúc.

Cây Me rừng là loại cây gỗ nhỏ, ưa sáng và ưa nhiệt, có khả năng chịu hạn rất tốt Thân cây cao từ 2 đến 7 mét, phân nhiều cành nhỏ mềm, có lông, dài khoảng 20cm.

Cây có lá xếp thành hai dãy trên các cành nhỏ, giống như lá kép lông chim với cuống lá ngắn và lá kèm nhỏ hình ba cạnh Hoa của cây nhỏ, đơn tính cùng gốc, mọc thành xim co ở nách lá phía dưới cành, gồm nhiều hoa đực và vài hoa cái Quả cây hình cầu, ban đầu mọng nước sau đó khô lại thành quả nang, hạt có hình ba cạnh và màu hồng nhạt Thời gian ra hoa của cây kéo dài từ tháng 3 đến tháng 11 hàng năm.

Hình 1.1 Cây Me rừng Hình 1.2 Vỏ thân cây Me rừng

Các nghiên cứu về dược tính của cây Me rừng

1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền

Dựa trên các nghiên cứu y học cổ truyền, mọi bộ phận của quả Me rừng đều có công dụng chữa bệnh Tại Ấn Độ, quả Me rừng được sử dụng trong nhiều bài thuốc cổ truyền để điều trị sỏi niệu và các bệnh về gan, đồng thời có tác dụng bảo vệ gan khỏi độc hại Ở Việt Nam, quả Me rừng khô thường được dùng để trị tiêu chảy và đau bụng Đặc biệt, quả Me rừng còn là nguồn cung cấp vitamin C dồi dào.

Myrobalan emblic có tác dụng chữa bệnh cảm mạo, sốt, ho, đau cổ họng và miệng khô khát bằng cách sử dụng từ 10 đến 30 quả sắc uống mỗi ngày Ngoài ra, nó còn giúp điều trị bệnh tiểu đường, ho, lợi tiểu và nhuận tràng Rễ cây có vị đắng, chát và tính mát, được dùng để chữa viêm ruột, đau bụng tiêu chảy và cao huyết áp (15-20g sắc uống mỗi ngày) Lá cây có thể nấu nước để rửa bên ngoài, giúp trị lở loét và mẩn ngứa Vỏ thân cây và rễ cũng có tác dụng lợi tiểu, chữa phù thũng và tăng huyết áp.

1.2.2 Dược tính theo y học hiện đại

Cây Me rừng đã được nghiên cứu rộng rãi trong y học hiện đại về dược tính của nó, với nhiều công trình tập trung vào các hợp chất quan trọng như acid gallic, acid ellagic, phyllaemblicin B, phyllaemblicin C, putranjivain A, và emblicamin A và B Những nghiên cứu này đã chỉ ra tác dụng dược lý đa dạng của các hợp chất này, mở ra tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực y tế.

 Tác dụng kháng khuẩn và chống oxi hóa

Năm 2007, Xiaoli Liu và các cộng sự đã nghiên cứu thành công khả năng kháng khuẩn và chống oxi hóa từ dịch chiết quả Me rừng Dịch chiết này được thu nhận bằng phương pháp chiết xuất với chất lỏng siêu tới hạn và cao chiết với methanol.

Nghiên cứu cho thấy cao chiết từ phương pháp chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn có khả năng kháng khuẩn hiệu quả đối với các vi khuẩn gram âm như E coli, P aeruginosa, S typhi, cũng như các vi khuẩn gram dương như S aureus, B cereus và B subtilis, và cả nấm như C abican, C tropicalis và A niger gây hại cho thực phẩm Kết quả này mở ra cơ hội sử dụng sản phẩm tự nhiên để kiểm soát vi khuẩn và bảo quản thực phẩm.

Vào năm 2016, nghiên cứu của Sirinya Pientaweeratch và cộng sự đã chỉ ra rằng dịch chiết ethanol từ quả Me rừng có khả năng chống oxi hóa đáng kể Cụ thể, nồng độ ức chế 50% (IC50) được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DDPH) là 1.700.07 mg/mL, trong khi phương pháp khử gốc tự do 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) cho kết quả là 4.450.10 mg/mL.

 Tác dụng bảo vệ gan

Năm 2008, S.K El-Desouky và các cộng sự đã công bố rằng dịch chiết từ vỏ thân cây Me rừng chứa các hợp chất phenolic, flavonoid và tanin Kết quả thử nghiệm trên chuột cho thấy dịch chiết này có khả năng chống lại rối loạn chức năng gan do tác động của ethanol.

Năm 2010, nghiên cứu của Sharma Bhawna và các cộng sự đã chỉ ra rằng dịch chiết ethanol từ cây Me rừng có khả năng hạ men gan và phục hồi chức năng gan ở chuột, với liều lượng 75 mg/kg/ngày.

Vào năm 2011, Yang Fei Xiang cùng các cộng sự đã thành công trong việc cô lập hợp chất 1,2,4,6‐tetra‐O‐galloyl‐β‐D‐glucose (75) Sau đó, họ đã tiến hành một loạt thử nghiệm để đánh giá tác dụng chống virus HSV (Herpes Simplex virus) loại 1 và 2 (HSV-1 và HSV-2).

1 và HSV-2) Kết quả cho thấy rằng hoạt chất này ngăn chặn được sự lây nhiễm virus trong tế bào ở giai đoạn đầu [26]

Năm 2017, He Yan và các cộng sự đã phát hiện hai hợp chất chalconoid, emblirol A và emblirol B, từ dịch chiết rễ Me rừng, có khả năng kháng virus khảm thuốc lá (TMV) với tỷ lệ ức chế lần lượt là 79,6% và 82,1% ở nồng độ thử nghiệm 1mg/mL.

 Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Năm 2012, Xiaoli Liu cùng các cộng sự đã cô lập từ cao etyl acetat của quả

The study investigates the biological activity of certain compounds, specifically tannins (41–52) and flavonoids (70–73), revealing their potential cytotoxic effects on breast cancer cells Notably, the compound isocorilagin (41) demonstrates a significant inhibitory effect on HELF (Human Embryonic Lung Fibroblast) cells, achieving a 50% inhibition concentration.

Năm 2013, Xinxian Zhu và các cộng sự đã công bố một nghiên cứu cho thấy chiết xuất giàu polyphenol từ cây Me rừng có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) hiệu quả nhất ở nồng độ 150 mg/mL.

Các nghiên cứu về thành phần hóa học

Nghiên cứu cho thấy các bộ phận của cây Me rừng, bao gồm lá, quả, cành và rễ, chứa nhiều hợp chất quan trọng như alkaloid, benzenoid, coumarin, phenolic, tanin, terpenoid, steroid và flavonoid.

Bảng 1.1 Một số hợp chất đã được cô lập từ cây Phyllanthus emblica Linn

Nhóm hợp chất Hợp chất Bộ phận cây

Tài liệu tham khảo Alkaloid

3,5-Di-O-galloyl1,4-lactone mucic acid

2-O-Galloyl-1,4-lactone mucic acid methyl ester (17) [26]

3,5-Di-O-galloyl-1,4-lactone mucic acid methyl ester (20) [26]

3-O-β-D-(6'-O- Hexanedecanoylglucopyranosyl)stigma st-5-ene-3β-ol (68)

3-O-β-D-(6'-O- Hexanedecanoylglucopyranosyl)stigma st-5-ene-3β,7β-diol (69)

(69) R 1 =OH, R 2 =OOC(CH 2 ) 14 CH 3 (71) R=OH

Hình 1.3 Cấu trúc của một số hợp chất trong cây Phyllanthus emblica Linn.

THỰC NGHIỆM

Hóa chất, thiết bị, phương pháp

- Silica gel: silica gel 40–63μm, Merck và silica gel 230–400μm, Himedia dùng cho sắc kí cột

- Silica gel pha đảo, RP–18, Merck dùng cho sắc kí cột

- Sắc kí lớp mỏng loại DC – Alufolein 20×20, Kiesel gel 60 F254, Merck

- Sắc kí lớp mỏng loại 25DC, RP–18, Merck

- Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: n–hexane, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol, acetic acid và nước cất

- Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng dung dịch

- Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu

- Máy cô quay chân không

- Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm

 Phương pháp phân lập các hợp chất

Cô lập các hợp chất hữu cơ có thể thực hiện thông qua các phương pháp sắc ký hiệu quả, bao gồm kỹ thuật sắc ký cột silica gel với pha thường, pha đảo RP-18 và sắc ký lớp mỏng Những kỹ thuật này giúp tách biệt và phân tích các hợp chất một cách chính xác, mang lại kết quả tin cậy trong nghiên cứu hóa học.

Để phát hiện vết chất hữu cơ trên sắc ký lớp mỏng, có thể sử dụng đèn tử ngoại với hai bước sóng 254 nm và 365 nm Ngoài ra, cũng có thể áp dụng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20% và nung nóng bảng mỏng để xác định sự hiện diện của chất hữu cơ.

 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và 2D-NMR đã được ghi lại trên máy Bruker Avance tại phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, 227 Nguyễn Văn Cừ, quận 5, TP Hồ Chí Minh, cùng với Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Phòng 133, nhà A18, Viện Hóa học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.

Nguyên liệu

Vỏ thân cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) được sử dụng làm mẫu nghiên cứu trong khoá luận, được thu hái tại xã Tân Tiến, thị xã La Gi, tỉnh Bình Thuận vào tháng 5 năm 2014.

Cây được TS Phạm Văn Ngọt từ khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, xác nhận với tên khoa học là “Phyllanthus emblica Linn.”, thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).

2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu

Nguyên liệu được rửa sạch và loại bỏ sâu bệnh, sau đó phơi khô trong bóng râm để giữ nguyên chất lượng Tiếp theo, nguyên liệu được xay thành bột mịn và tiến hành ngâm chiết để phân lập các hợp chất.

Điều chế các loại cao

Vỏ thân cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) được phơi khô, nghiền thành bột mịn và sấy khô đến khối lượng không đổi là 16.2kg Nguyên liệu bột mịn này sau đó được chiết xuất bằng ethanol 96% thông qua phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay dung môi dưới áp suất thấp, thu được 350.5g cao ethanol thô.

Cao ethanol thô đã được chiết xuất bằng phương pháp lỏng–lỏng với n–hexane và ethyl acetate, dẫn đến việc thu được 11.5g cao hexane, 85.4g cao ethyl acetate và 224.8g cao còn lại Quá trình chiết xuất này được trình bày tóm tắt trong sơ đồ 2.1.

Cô lập các hợp chất hữu cơ có trong cao ethyl acetate

2.4.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate

Cao ethyl acetate (85.4g) được tách chiết bằng SKC silica gel, sử dụng hệ dung môi H:EA với độ phân cực tăng dần từ 70% đến 100% EA, sau đó tiếp tục với hệ dung môi EA:Me có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me Dịch giải ly được thu vào các lọ và quá trình giải ly được theo dõi bằng SKLM Các lọ có kết quả SKLM giống nhau được gom lại thành một phân đoạn, tổng cộng thu được 9 phân đoạn (EA1 – 9) như trình bày trong bảng 2.1.

Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate

Sắc kí lớp mỏng Ghi chú

1 EA1 H:EA (95:5) 4.1 Nhiều vết tách xa Đã khảo sát

2 EA2 H:EA (9:1) 5.4 Nhiều vết, kéo dài Đã khảo sát

3 EA3 H:EA (85:15) 12.6 Nhiều vết, kéo vệt Chưa khảo sát

4 EA4 EA:Me (99:1) 4.6 Nhiều vết Đã Khảo sát

- Chiết lỏng – lỏng với dung môi n–hexane

- Lọc, cô quay, thu hồi dung môi

- Chiết lỏng – lỏng với dung môi ethyl acetate

- Lọc, cô quay, thu hồi dung môi

Bột vỏ thân cây khô (16.2kg)

Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế các loại cao từ vỏ thân cây Me rừng

5 EA5 EA:Me (95:5) 6.2 Nhiều vết tách xa Đã khảo sát

6 EA6 EA:Me (9:1) 11.2 Nhiều vết, kéo dài Chưa khảo sát

9 EA9 Me (100%) 9.8 Nhiều vết, kéo dài Chưa khảo sát

2.4.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 của bảng 2.1

Phân đoạn EA4 (4.6g) SKLM có nhiều vết và hiện hình màu tím dưới đèn tử ngoại, do đó được chọn SKC silica gel Quá trình giải ly được thực hiện với hệ dung môi H:Ac có độ phân cực tăng dần từ 75% đến 100% EA, tiếp theo là giải ly với hệ dung môi EA:Me có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me Các bước thực hiện tương tự như trong sắc kí cột phân đoạn trước Kết quả thu được 8 phân đoạn (EA4.1 – EA4.8) được ghi lại trong bảng 2.2.

Bảng 2.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA 4

STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng

Sắc kí lớp mỏng Ghi chú

Có vết trùng với vết glycoside của stigmasterol

Có vết trùng với vết của lupeol

Khảo sát thu được hợp chất PA1

4 EA4.4 H:Ac (8:2) 449.9 Nhiều vết Chưa khảo sát

5 EA4.5 H:Ac (7:3) 375.9 Nhiều vết, kéo vệt Chưa khảo sát

6 EA4.6 H:Ac (6:4) 536.6 3 vết Khảo sát thu được hợp chất PEE04

7 EA4.7 EA:Me (95:5) 421.3 Nhiều vết

Khảo sát thu được hợp chất PA2

8 EA4.8 EA:Me (9:1) 312.9 Nhiều vết, kéo vệt Chưa khảo sát

2.4.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.6 của bảng 2.2

Phân đoạn EA4.6 (536.6mg) được tách bằng hệ dung môi C:Me với độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me, thực hiện các bước tương tự như trong sắc kí cột phân đoạn trước Kết quả thu được 6 phân đoạn, bao gồm EA4.6.1 đến EA4.6.6, và được trình bày trong bảng 2.3.

Bảng 2.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.6

STT Phân đoạn Dung môi giải ly

Khối lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú

1 EA4.6.1 C:Me (95:5) 68.6 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát

3 EA4.6.3 C:Me (9:1) 161.7 Nhiều vết, tách rõ

Tinh chế thu được hợp chất PEE04

Phân đoạn EA4.6.3 (161.7mg) trong bảng 2.3 đã được khảo sát với SKLM, cho thấy vết màu xanh và hai vết dơ kéo dài Do đó, cần tiếp tục thực hiện SKC nhiều lần với hệ dung môi C:Ac, từ đó thu được hợp chất dạng bột màu trắng, được kí hiệu là PEE04 (5.8mg).

Phân đoạn EA4.3 (554.7mg) được thực hiện bằng hệ dung môi H:Ac với độ phân cực tăng dần từ 20% đến 100% Ac, theo quy trình tương tự như khi SKC phân đoạn trước Kết quả thu được 5 phân đoạn, từ EA4.3.1 đến EA4.3.5, được trình bày trong bảng 2.4.

1 EA4.3.1 H:Ac (9:1) 143.7 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát

2 EA4.3.2 H:Ac (9:1) 121.3 Nhiều vết, tách rõ

Tinh chế thu được hợp chất PA1

Trong quá trình khảo sát phân đoạn EA4.3.2 (121.3mg) theo phương pháp SKLM, đã phát hiện nhiều vết màu cam và vết dơ, nhưng các vết tách rõ ràng Do đó, tiếp tục thực hiện SKC nhiều lần với hệ dung môi H:Ac:AcOH, thu được hợp chất dạng hình kim màu trắng, được ký hiệu là PA1 (5.9mg).

Phân đoạn EA4.7 (421.3mg) đã được tách bằng hệ dung môi C:Me với độ phân cực tăng dần từ 10% đến 100% Me, thực hiện các bước tương tự như trong sắc kí cột phân đoạn trước Kết quả thu được 6 phân đoạn, được đánh số từ EA4.7.1 đến EA4.7.6, và được trình bày chi tiết trong bảng 2.5.

3 EA4.7.3 C:Me (9:1) 100.7 Nhiều vết, tách rõ

Tinh chế thu được hợp chất PA2

Phân đoạn EA4.7.3 (100.7mg) đã được khảo sát và cho thấy vết màu nâu khi sử dụng SKLM, cùng với bốn vết dơ không hiện hình dưới đèn tử ngoại nhưng tách rõ Qua nhiều lần SKC với hệ dung môi C:Ac:AcOH, một hợp chất dạng bột màu trắng có tên PA2 (10.9mg) đã được thu được.

Dưới đây là sơ đồ trình bày quy trình cô lập một số hợp chất từ cao ethyl acetate

Sơ đồ 2.2 Quy trình cô lập một số hợp chất từ cao ethyl acetate

Tiêu đề	Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Của Vỏ Thân Cây Me Rừng Phyllanthus Emblica Linn
Tác giả	Phạm Bảo Quý
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết
Trường học	Trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Hóa Học
Thể loại	Khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2018
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	65
Dung lượng	5,25 MB