Sâm Hàn Quốc (panax ginsieng c.a meyer) Ngày nay như chúng ta đã biết cuộc sống của con người không còn lo ăn no mặc ấm nữa mà ngày nay con người luôn hướng đến ăn ngon mặc đẹp và điều đặc biệt là coi trọng vấn đề sức khỏe hơn nhiều vì vậy những thực phẩm có lợi cho sức khỏe ngày càng được phổ biến một trong những loại thực phẩm phổ biến thì phải nói đến nhân sâm. Nhân sâm không còn là thực phẩm quá xa xỉ. đối với mọi người Chỉ bỏ ra một số tiền là bạn có thể sử dụng loại thần dược này rồi. Trong các loại nhân sâm, thì nhân sâm Hàn Quốc là phổ biến và có tác dụng tốt nhất. Nhân sâm Hàn Quốc có tên khoa học Panax Ginseng C.A. Meyer thuộc họ Araliaceae là một loài thảo dược quý hiếm và rất khó trồng. Trong tự nhiên, nhân sâm phải trải qua thời gian sinh trưởng kéo dài mới cho phẩm chất thu hoạch tốt, đặc biệt là hàm lượng Saponin triterpen tích lũy trong các cơ quan bộ phận của cây. Người ta đã đưa nhân sâm vào trong canh tác truyền thống để sản xuất với số lượng lớn. Tuy nhiên, việc sản xuất trên môi trường đất trồng nông nghiệp phải trải qua chu kỳ sản xuất dài (57 năm) mới đáp ứng các yêu cầu về chất lượng cho thu hoạch và sự sinh trưởng của nhân sâm phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi trường bên ngoài như đất, khí hậu, mầm bệnh và sâu bệnh (Theo Hosakatte Niranjana Murthy và ctg, 2014). Việc sử dụng tế bào và cơ quan nuôi cấy đã được tìm kiếm như một giải pháp thay thế tiềm năng để sản xuất hiệu quả các hợp chất thứ cấp từ nhân sâm. Các bài nghiên cứu chủ yếu các nhà nghiên cứu nghiên cứu về nghiên cứu nuôi cấy tế bào và rễ của nhân sâm để tích lũy sinh khối và hàm lượng saponin trong các lò phản ứng sinh học (Bioreactor) quy mô lớn đã được tiến hành. Kết quả nghiên cứu và thử nghiệm tại CBN Biotech Company, South Korea cho thấy khi trồng trong các lò phản ứng sinh học, rễ sâm sinh trưởng nhanh, tích lũy hàm lượng các chất thứ cấp cao trong thời gian ngắn hơn so với khi trồng theo phương thức truyền thống và trong tự nhiên (Theo Hosakatte Niranjana Murthy và ctg, 2014).
Tính cấp thiết của đề tài
Nhân sâm Hàn Quốc (Panax ginseng C.A Meyer) ngày nay đã trở thành một trong những thực phẩm được ưa chuộng, đặc biệt trong bối cảnh con người ngày càng chú trọng đến sức khỏe Không còn là một món ăn xa xỉ, nhân sâm giờ đây có thể dễ dàng tiếp cận với mức giá hợp lý Trong số các loại nhân sâm, nhân sâm Hàn Quốc nổi bật với những tác dụng tốt nhất, đáp ứng nhu cầu ăn ngon, mặc đẹp và chăm sóc sức khỏe của mọi người.
Nhân sâm Hàn Quốc, tên khoa học là Panax Ginseng C.A Meyer, thuộc họ Araliaceae, là một loại thảo dược quý hiếm và khó trồng Để đạt được phẩm chất tốt nhất, nhân sâm cần trải qua thời gian sinh trưởng dài, đặc biệt là để tích lũy hàm lượng Saponin triterpen trong các bộ phận của cây Mặc dù đã được đưa vào canh tác truyền thống để sản xuất số lượng lớn, quá trình này vẫn cần từ 5 đến 7 năm để đáp ứng yêu cầu chất lượng Sự sinh trưởng của nhân sâm còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi trường như đất, khí hậu, và sự xuất hiện của mầm bệnh cũng như sâu bệnh.
Việc sử dụng tế bào và cơ quan nuôi cấy đã được nghiên cứu như một giải pháp tiềm năng để sản xuất hiệu quả các hợp chất thứ cấp từ nhân sâm Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc nuôi cấy tế bào và rễ nhân sâm trong các lò phản ứng sinh học quy mô lớn nhằm tích lũy sinh khối và hàm lượng saponin Kết quả từ CBN Biotech Company, Hàn Quốc cho thấy rằng rễ sâm trồng trong lò phản ứng sinh học phát triển nhanh chóng và tích lũy hàm lượng các chất thứ cấp cao hơn trong thời gian ngắn so với phương pháp trồng truyền thống và tự nhiên.
Chưa có nghiên cứu nào đề cập đến việc nuôi cấy hạt nhân sâm Hàn Quốc để tạo ra cây hoàn chỉnh thông qua phương pháp nuôi cấy Invitro Do đó, cần thiết phải tiến hành nghiên cứu về việc nhân giống sâm Hàn Quốc bằng hạt sâm.
Việt Nam đang phát triển ngành công nghiệp dược phẩm và xuất khẩu thông qua việc trồng nhân sâm tại các vùng núi cao như Đà Lạt, Sapa, Tam Đảo, tận dụng lợi thế về khí hậu và thổ nhưỡng để tạo ra vùng nguyên liệu Nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi trồng nhân sâm trong nuôi cấy Invitro đang được chú trọng nhằm đáp ứng nhu cầu sản xuất thương mại Tuy nhiên, hiện nay vẫn thiếu tài liệu nghiên cứu về môi trường dinh dưỡng phù hợp cho hạt nhân sâm, do đó, việc nghiên cứu và nhân giống hạt sâm trong Invitro là rất quan trọng để sản xuất nhân sâm phục vụ nhu cầu ngày càng cao của con người.
Cây thanh mai là một loại cây hoặc cây bụi lớn có nguồn gốc ở các ngọn đồi ở phía bắc Ấn Độ và Nepal
Tên phổ biến bao gồm hộp myrussy , bayberry và kaphal
Trong tự nhiên cây thanh mai sinh trưởng và phát triển rất là tốt vì cây thanh mai này có nguồn gốc là từ cây rừng
Cây thanh mai, hay còn gọi là Myrica esculenta, chủ yếu được tìm thấy ở các chân đồi của Đông Hy Mã Lạp Sơn, bao gồm Meghalaya, Nepal, Trung Quốc và Pakistan Trái cây của cây này được sử dụng bởi các bộ lạc địa phương để chế biến đồ uống dưa chua và giải khát Tại khu vực Ấn Độ thuộc dãy núi Himalaya, Myrica esculenta là một trong hơn 675 loài phù du hoang dã, phát triển ở độ cao từ 900 đến 2100 m so với mực nước biển Loài cây này phân bố rộng rãi từ Ravi về phía đông đến Assam, bao gồm các khu vực Khasi, Jaintia, Naga và đồi Lushi, và còn kéo dài đến Malaya, Singapore, Trung Quốc và Nhật Bản.
Loài cây này được người dân địa phương yêu thích nhờ vào các loại trái cây và sản phẩm chế biến thơm ngon Nó có nhiều nét tương đồng với Myrica rubra, loài thường gặp ở Trung Quốc và Nhật Bản.
Những quả chín của hạt thanh mai (M esculenta ) được thu thập trong tháng 5 năm 2008, từ những quần thể hoang dã nằm ở xa (tức là Kalika (1775), Ayarpani
Năm 1650, Shyamkhet (1975), Gwaldom (1925) và Doonagiri (2100 m asl) ở Uttarakhand, Ấn Độ, là nơi thu thập mẫu quả Sau khi thu thập, quả được đưa đến phòng thí nghiệm và bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ 4 °C Các mẫu chứng từ đã được gửi đến Viện Môi trường và Phát triển Hy Lạp G B Pant, Kosi-Katarmal, Almora để bảo quản hạt giống cho các nghiên cứu sau này Tại Việt Nam, cây thanh mai được phát hiện ở một số tỉnh miền Trung và Tây Nguyên, nhưng nhiều nhất là ở Quảng Ninh, nơi thanh mai mọc rải rác khắp các đảo đá từ gần bờ đến xa bờ.
Hiện nay, việc giao đất và giao rừng để trồng cây lấy gỗ đã dẫn đến sự thu hẹp diện tích rừng tự nhiên Nhiều loại cây rừng, trong đó có cây thanh mai, đang bị thay thế bởi cỏ lau và các loại cây công nghiệp khác.
Trong những năm gần đây, thanh mai ngày càng được ưa chuộng, dẫn đến nhu cầu tìm kiếm giống và trồng thử nghiệm nuôi cấy trong INVITRO để nhân giống rộng rãi Việc này không chỉ đáp ứng nhu cầu của con người mà còn giúp đánh giá phạm vi biến đổi của các chất chống oxy hóa có trong hạt thanh mai Sử dụng các phương pháp khác nhau trong INVITRO sẽ giúp xác định nguồn gốc và thành phần bên trong hạt thanh mai, khẳng định đây là loại trái cây tốt cho sức khỏe con người.
Mục đích của đề tài
Xác định nồng độ TCCA khử trùng nào thích hợp cho nuôi cấy hạt nhân sâm trong Invitro
Xem xét môi trường MS
Xác định nồng độ TCCA khử trùng nào thích hợp cho nuôi cấy hạt và chồi cây thanh mai trong Invitro
Xác định môi trường dinh dưỡng phù hợp cho nuôi cấy hạt và chồi cây thanh mai trong Invitro.
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁT NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu hạt sâm
Thời gian: từ ngày 28/12/2018 đến 2/05/2019 Địa điểm: các thí nghiệm trong đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiêm của Viện Nghiên trường Đại học Đà Lạt.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu hạt cây thanh mai
Thời gian: từ ngày 10/02/2018 đến 2/05/2019 Địa điểm: các thí nghiệm trong đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiêm của Viện Nghiên trường Đại học Đà Lạt.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu chồi thanh mai
Thời gian: từ ngày 9/04/2018 đến 2/05/2019 Địa điểm: các thí nghiệm trong đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiêm của Viện Nghiên trường Đại học Đà Lạt
2.3.1 Các nội dung nghiên cứu về hạt sâm:
Khảo sát nồng độ TCCA khử trùng nào thích hợp cho nuôi cấy hạt nhân sâm trong Invitro
Khảo sát mức độ nhiễm đối với hai mẫu sâm lột vỏ và không lột vỏ
Khảo sát đánh giá các chỉ tiêu của cây sâm bao gồm tỷ lệ mẫu nhiễm nấm, mẫu nhiễm khuẩn, mẫu sạch, chiều cao cây và trọng lượng tươi Những yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định chất lượng và sức khỏe của cây sâm.
2.3.2 Các nội dung nghiên cứu về hạt thanh mai:
So sánh giữa chất khử trùng TCCA và Javen chất khử trùng nài đem lại hiệu quả cao hơn
Khảo sát đánh giá các chỉ tiêu của cây thanh mai bao gồm mẫu nhiễm nấm, mẫu nhiễm khuẩn, mẫu sạch, chiều cao cây và trọng lượng tươi của cây Những chỉ tiêu này giúp xác định tình trạng sức khỏe và sự phát triển của cây thanh mai trong quá trình sinh trưởng.
2.3.3 Các nội dung nghiên cứu về chồi thanh mai:
Khảo sát nồng độ TCCA khử trùng nào thích hợp cho nuôi cấy chồi thanh mai trong Invitro
So sánh giữa chất khử trùng TCCA và Javen chất khử trùng nài đem lại hiệu quả cao hơn
Khảo sát đánh giá các chỉ tiêu của cây thanh mai bao gồm việc phân tích mẫu nhiễm nấm, mẫu nhiễm khuẩn và mẫu sạch Ngoài ra, nghiên cứu cũng xem xét chiều cao cây và trọng lượng tươi của cây để đánh giá sự phát triển và sức khỏe tổng thể của cây thanh mai.
2.3.4 Đối tượng nghiên cứu về hạt sâm: Đề tài được tiến hành đối với hạt sâm tại nhà kính khoa nông lâm do đối tác khoa nông lâm cấp cung cấp và hạt sâm tự hái (hạt chín trên cây sâm) tại nhà kính khoa nông lâm tại Trường Đại Học Đà Lạt
Hạt sâm đã được đối tác từ khoa Nông Lâm tách vỏ và ủ, sau đó chuyển đến phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu Đại học Đà Lạt để tiến hành thí nghiệm.
Sơ đồ 1 Quá trình nghiên cứu về hạ sâm
Nhằm khử trùng mẫu để thu được mẫu sạch lắc mẫu thấy mẫu chuyển màu
Rửa lại nước cất 3 lần
Nhằm rửa sạch lại mẫu để lắc qua cồn
Khử trùng mẫu tạo độ sạch hoàn toàn cho mẫu
Rửa lại nước cất 3 lần
Rửa lại sạch cồn để cấy vào môi trường
2.3.5 Đối tượng nghiên cứu hạt thanh mai Đề tài được tiến hành đối với hạt cây thanh mai được thu thập mẫu tại rừng hỗn giao thông và cây thanh mai ở Hồ Tuyền Lâm Thành Phố Đà Lạt
Sơ đồ 2 Quá trình nghiên cứu về hạt thanh mai:
Nhằm khử trùng mẫu để thu được mẫu sạch lắc mẫu thấy mẫu chuyển màu
Rửa lại nước cất 3 lần
TN2: ngâm hạt trong nước cất vô trùng 24h
TN3: ngâm hạt trong nước cất vô trùng 48h
Nhằm rửa sạch lại mẫu để lắc qua cồn
Khử trùng mẫu tạo độ sạch hoàn toàn cho mẫu
Rửa lại nước cất 3 lần TN4: ngâm hạt trong nước cất vô trùng 72h
Rửa lại sạch cồn để cấy vào môi trường HẠT THANH MAI
2.3.6 Đối tượng nghiên cứu: Đề tài được tiến hành đối với chồi cây thanh mai đi thu thập mẫu tại Hồ Tuyền Lâm
Sơ đồ 3 Quá trình nghiên cứu về chồi thanh mai
Lựa chọn hạt sâm nguyên liệu
Mục tiêu: Lựa chọn được hạt sâm không bị mốc đen, mang lại hiệu quả cho quá trình nghiên cứu chọn hạt không bị vỡ trầy xướt
Mẫu hạt sâm gồm 2 loại: Đối với hạt phơi khô (tự hái): (không tách vỏ) đem hạt rửa dưới vòi nước khoảng 30 phút
Lắc trong TCCA JAVEN 30 phút
Nhằm khử trùng mẫu để thu được mẫu sạch lắc mẫu thấy mẫu chuyển màu
Rửa lại nước cất 3 lần TN2: khử trùng Nồng độ TCCA 500
TN3: khử trùng Nồng độ JAVEN 5%
Nhằm rửa sạch lại mẫu để lắc qua cồn
Khử trùng mẫu tạo độ sạch hoàn toàn cho mẫu
Rửa lại nước cất 3 lần
Cấy vào môi trường rửa lại sạch cồn để cấy vào môi trường
Pha xà phòng rồi bỏ hạt vào lắc trong 30 phút
Hình 4 Pha xà phòng rồi bỏ hạt vào lắc trong 30 phút
Sau khi xả sạch xà phòng, hãy cho hạt vào tủ cấy vô trùng và lắc với nước cất vô trùng ba lần Đối với hạt phơi khô, cần chuẩn bị 225 hạt, bao gồm 5 nghiệm thức với 3 lần lặp Mỗi lần lặp có 3 bịch, mỗi bịch chứa 5 hạt, do đó 1 nghiệm thức sẽ có 45 hạt, tổng cộng cho 5 nghiệm thức là 225 hạt.
Kí hiệu: 1.1, 2.1, 3.1,4.1,5.1 trên miệng bịch môi trường
Để xử lý hạt vỏ đã nứt (do MR Kan từ khoa nông lâm cung cấp), trước tiên cần rửa hạt dưới vòi nước trong khoảng 30 phút Sau đó, pha xà phòng và ngâm hạt trong dung dịch này trong 30 phút, rồi xả sạch với nước để loại bỏ xà phòng Tiếp theo, lắc hạt trong cồn 70 độ trong 1 phút và cho hạt vào tủ cấy Cuối cùng, lặp lại quy trình lắc hạt trong nước cất vô trùng ba lần, cần chuẩn bị tổng cộng 225 hạt như đã nêu.
Kí hiệu: 1, 2, 3, 4, 5 Trên miệng bịch môi trường
Hình 6 Lựa lịch thước hạt thanh mai
Mỗi trường hợp lấy nhiều hơn 225 hạt để đem đi xử lý mẫu, để tránh hiện tượng hao hụt mẫu (trong quá trình khử trùng mẫu)
Dụng cụ nghiên cứu trong nuôi cấy sâm Hàn Quốc bao gồm các hóa chất để pha môi trường, cân hóa chất, bịch ni lông đựng môi trường, tủ cấy và các dụng cụ đo lường, định mức.
Lựa chọn hạt thanh mai nguyên liệu
Mục tiêu: Lựa chọn được hạt thanh mai đực được hái ở trên cây ở Hồ Tuyền Lâm những hạt đã chín có màu đỏ hoặc đỏ sẫm
Thực hiện xử lý mẫu:
Mẫu hạt thanh mai đực được thu hoạch, rửa sạch và cạo bỏ lớp vỏ thịt bên ngoài Sử dụng giấy nhám để chà vỏ cho đến khi bề mặt quả nhẵn mịn, không còn lông Cuối cùng, hạt được phơi nắng khoảng 15 phút để đảm bảo độ khô.
Tiếp theo đó chuẩn bị 4 lọ thủy tinh để cho hạt vào ngâm trong nước cất vô trùng mỗi lọ cho vào 40 hạt
Hình 9 Ngâm mẫu hạt thanh mai
Sau thời gian ngâm hạt ta cho tất cả các hạt đã ngâm vào trong tủ cấy vô trùng
Lựa chồi thanh mai nguyên liệu
Mục tiêu: Lựa chọn những chồi thanh mai đực non có màu xanh còn trên cành được hái ở trên cây ở Hồ Tuyền Lâm
Thực hiện xử lý mẫu:
Cắt tỉa các phần lá và thân non còn xanh, sau đó cho vào rổ và xả dưới vòi nước mạnh Dùng bát chà nhẹ để rửa sạch mẫu.
Pha xà phòng để cho mẫu vào để lắc mạnh tay 30 phút rồi xả lại với vòi nước
Sau đó đưa mẫu vào tủ cấy vô trùng để tiếp tục lắc qua TCCA và JAVEN
Hình 11 Lắc hạt thanh mai qua TCCA và JAVEN
Nội dung nghiên cứu
2.4.1 Pha TCCA với các nồng độ khác nhau để khử mẫu hạt sâm Hàn quốc
Pha TCCA với 5 nồng độ khác nhau:200, 300, 400, 500,600 (mg/l) trong 500ml
Để khử trùng mẫu hạt sâm, đầu tiên cân 0,3g TCCA và hòa tan vào 5 hộp nước cất vô trùng, khuấy đều để tạo dung dịch TCCA Đối với hạt sâm chưa bóc vỏ, cho vào các môi trường khác nhau và lắc trong khoảng 15-30 phút cho đến khi mẫu chuyển màu Sau đó, rửa lại bằng nước cất vô trùng ba lần để loại bỏ chất khử trùng Đối với hạt sâm nứt vỏ, quy trình tương tự được áp dụng, nhưng với hạt đã bóc vỏ, nồng độ TCCA cao hơn sẽ rút ngắn thời gian lắc, giúp mẫu nhanh chóng chuyển sang màu nâu đen.
2.4.2 Môi trường nuôi cấy hạt sâm Hàn Quốc:
Môi trường: 1MS pha trong 5 lít bao gồm các hóa chất
MSG: 1ml *5 = 5ml ĐƯỜNG: 30 gam / lít *5= 150g
BA: pha môi trường MS bổ sung 0,5mg BA/ lít
Pha trong 5 lít * 0,5= 2,5mg BA
Thì 2,5mg BA thì cần 5 lít nước cần dùng
Lượng Agar bổ sung: thường 8,5g / lít pha 5 lít *8,5 B,5g
Pha xong môi trường phải đo độ PH về 5,8 hoặc 6
Hấp môi trường và bịch trong nồi hấp ở nhiệt độ 121 độ c
Hấp xong đợi môi trường nguội rồi đổ môi trường vào bịch
Sau một thời gian kiếm tra môi trường rồi vào mẫu để nuôi cấy hạt sâm
Sau khi pha xong môi trường, cho vào các chai nhựa và bịt kín miệng chai, sau đó hấp môi trường ở nồi hấp với nhiệt độ 121 độ C trong 20 phút Sau khi hấp xong, đổ môi trường vào các bịch nilong đã được khử trùng, thực hiện thao tác trong tủ cấy để đảm bảo an toàn Từ 5 lít môi trường, có thể đổ được khoảng 500 bịch nhỏ.
Sau khi ký hiệu tên môi trường và ngày đổ, hãy sắp xếp chúng lên các kệ trong khoảng 3-4 ngày để kiểm tra lại môi trường Chỉ sau đó mới tiến hành cấy mẫu vào môi trường đã pha.
Sau 4 ngày lên kiểm tra mẫu loại bỏ những bịch có mẫu bị nhiễm nấm và khuẩn
Thao tác thực hiện cấy hạt sâm:
Trước khi đưa mẫu vào tủ cấy vô trùng, cần lau dọn sạch sẽ và chuẩn bị tủ cấy Dụng cụ cấy cần được khử trùng bằng lửa với nhiệt độ 98 độ Sau đó, xịt cồn vào môi trường MS đã pha và đưa vào tủ cấy để tiến hành cấy mẫu.
Sau đó đưa mẫu vào tủ cấy và cho vào một cái chai để thực hiện lắc mẫu trong vòng 30 phút
Sau khi lắc TCCA trong 30 phút, mẫu cần được rửa bằng nước cất vô trùng ba lần Tiếp theo, cho mẫu vào cồn 70 độ và lắc trong khoảng 2 phút để khử trùng hoàn toàn, đảm bảo độ sạch cho mẫu Do vỏ hạt sâm khá cứng, việc lắc qua cồn không làm tổn thương hạt bên trong Sau đó, mẫu được rửa lại với nước cất ba lần nữa trước khi cấy vào môi trường MS đã chuẩn bị sẵn.
Sử dụng panh cấy để lấy mẫu hạt sâm, đặt chúng lên giấy đã được hấp khử trùng Tiếp theo, gắp từng mẫu hạt sâm vào môi trường MS, gấp miệng bịch lại và ghi ký hiệu lên trên Cuối cùng, sắp xếp các bịch lên dàn cấy để chuẩn bị cho quá trình tiếp theo.
Mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại Đều thực hiện thao tác này đều thực hiện đối với như hai mẫu hạt sâm
Khi cấy mẫu hạt sâm, cần tránh chạm tay vào miệng bịch và không đưa tay qua lại giữa mẫu cấy và giấy, nhằm hạn chế tối đa nguy cơ nhiễm nấm bệnh trong quá trình thao tác.
Nội dung nghiên cứu hạt thanh mai
Pha TCCA với các nồng độ khác nhau để khử mẫu hạt thanh mai
Pha TCCA với nồng độ 400, 500 (mg/l) trong 500ml
2.5.1 Môi trường nuôi cấy hạt thanh mai
- Môi trường: 1/2 MS (pha 4 lít)
- BA: pha môi trường MS bổ sung 0,5mg BA/ lít
2mg BA -suy ra 4lít nước cần dùng
- Lượng Agar bổ sung: thường 8,5g / lít pha 4lít *8,5 = 34g
Pha TCCA với các nồng độ khác nhau để khử mẫu chồi thanh mai
*** Pha TCCA với nồng độ 400, 500 (mg/l) trong 500ml
2.5.2 Thao tác thực hiện cấy hạt thanh mai:
Trước khi đưa mẫu vào tủ cấy vô trùng, cần chuẩn bị và lau dọn tủ cấy sạch sẽ Để đảm bảo vệ sinh, đốt dụng cụ cấy bằng cồn 98 độ Sau đó, xịt cồn vào môi trường 1/2 MS đã pha và đặt vào trong tủ cấy để tiến hành cấy mẫu.
Sau đó đưa mẫu vào tủ cấy và cho vào một cái chai để thực hiện lắc mẫu trong vòng 30 phút
Sau khi lắc TCCA trong 30 phút, rửa mẫu bằng nước cất vô trùng ba lần Tiếp theo, ngâm mẫu trong cồn 70 độ và lắc trong khoảng 2 phút để khử trùng hoàn toàn, đặc biệt vì mẫu hạt thanh mai có vỏ cứng và lông Trong quá trình pha TCCA, thêm vài giọt TWEN 80 để tiêu diệt vi khuẩn Cuối cùng, lắc mẫu qua nước cất ba lần nữa trước khi cấy vào môi trường 1/2 MS đã chuẩn bị sẵn.
Hình 16 Mẫu được lắc qua TCCA
Sử dụng panh cấy để gắp mẫu hạt sâm ra một mảnh giấy đã được hấp khử trùng, sau đó đặt mẫu lên môi trường MS Gấp miệng bịch lại, ghi ký hiệu lên trên miệng bịch và sắp xếp bịch lên dàn cấy.
Mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại
Khi cấy mẫu hạt sâm, cần chú ý không chạm tay vào miệng bịch và tránh đưa tay qua lại giữa mẫu cấy và giấy Điều này giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh do thao tác không đúng cách.
Quy trình cấy và khử trùng mẫu hạt thanh mai và hạt sâm tương tự nhau, nhưng hạt thanh mai cần được ngâm trước khi cấy.
Nội dung nghiên cứu
Môi trường nuôi cấy hạt chồi thanh mai: pha 2 lít môi trường
Môi trường: 1/2 MS pha 2 lít
MSG: 1ml *2/2 = 1ml ĐƯỜNG: 30 gam / lít *2= 60g
BA: pha môi trường MS bổ sung 0,5mg BA/ lít
Thì 2mg BA thì cần 2lít nước cần dùng
Lượng Agar bổ sung: thường 8,5g / lít pha 2lít *8,5 = 17g
Thao tác thực hiện cấy chồi thanh mai:
Trước khi đưa mẫu vào tủ cấy vô trùng, cần lau dọn và chuẩn bị sạch sẽ Dụng cụ cấy phải được khử trùng bằng ngọn lửa 98 độ Sau đó, xịt cồn lên môi trường 1/2 MS đã pha và đưa vào trong tủ cấy để tiến hành cấy mẫu.
Sau đó đưa mẫu vào tủ cấy và cho vào một cái chai để thực hiện lắc mẫu trong vòng 30 phút
Sau khi lắc TCCA và JAVEN trong 30 phút, cần rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần Tiếp theo, cấy mẫu vào môi trường 1/2 MS đã chuẩn bị sẵn.
KẾT QUẢ NUÔI CẤY HẠT SÂM:
Cấy ngày 28/12 sau đó ngày 7/1 kiểm tra mẫu lần 1 Đối với hạt sâm không lột vỏ:
NT1: trong 45 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 15 hạt bị nhiễm nấm mốc, 10 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại là mẫu sạch 20 hạt
NT2: trong 45 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 10 hạt nhiễm nấm mốc, 10 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại là mẫu sạch 25 hạt
NT3: trong 45 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 9 hạt nhiễm nấm mốc, 8 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại là mẫu sạch 28 hạt
NT4: trong 45 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 5 hạt nhiễm nấm mốc, 4 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại là mẫu sạch 36 hạt
NT5: trong 45 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 4 hạt nhiễm nấm mốc, 4 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại là mẫu sạch 37 hạt
Hình 17 Mẫu bị nhiễm nấm
Hình 18.Mẫu bị nhiễm khuẩn
Biểu đồ thể hiện mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt sâm không lột vỏ:
Bảng 1 Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt sâm không lột vỏ
Biểu đồ 1 Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt sâm không lột vỏ Đối với hạt sâm nứt vỏ:
NT1: trong 45 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 10 hạt bị nhiễm nấm mốc, 8 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại là mẫu sạch 27 hạt
NT2: trong 45 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 9 hạt bị nhiễm nấm mốc, 8 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại là mẫu sạch 28 hạt
NT3: trong 45 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 7 hạt bị nhiễm nấm mốc, 5 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại là mẫu sạch 33 hạt
NT4: trong 45 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 5 hạt bị nhiễm nấm mốc, 5 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại là mẫu sạch 35 hạt
NT5: trong 45 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 5 hạt bị nhiễm nấm mốc, 4 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại là mẫu sạch 36 hạt
Hình 19 Mẫu bị nhiễm nấm
Hình 20 Mẫu sâm bị khuẩn
Biểu đồ thể hiện mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt sâm không lột vỏ:
Bảng 2 Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt sâm không lột vỏ
Biểu đồ 2 Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt sâm không lột vỏ
Cứ sau ngày 7/1 thì cách 2 ngày lên kiểm tra mẫu một lần thì mẫu sạch còn lại không bị nhiễm nấm hay khuẩn
Nhưng mẫu sâm vẫn không có hiện tượng ra rễ
Ngày 2/5 kiểm tra mẫu lần cuối: Đối với mẫu không lột vỏ:
Mẫu vẫn không bị nhiễm nấm và khuẩn và không có hiện tượng ra rễ
NT5: Đối với hạt nứt vỏ:
Cũng vẫn không có hiện tượng ra rễ
Trong quá trình theo dõi, cả hai mẫu hạt sâm không xuất hiện hiện tượng nứt và ra rễ Theo nghiên cứu, hạt sâm có khả năng nảy mầm ở nhiệt độ từ -2 đến 2 độ C, nhưng cần thời gian nghỉ ngơi trước khi chuyển sang điều kiện bình thường để nảy mầm Chúng tôi đã áp dụng một số phương pháp kích thích sinh trưởng cho hạt sâm, bao gồm bào mòn lớp vỏ hạt và ngâm trong axit sunfuric đậm đặc trong 8 phút để làm mềm lớp vỏ cứng, cũng như tách vỏ hạt sâm.
Hạt giống sâm hiện nay có nguồn gốc không rõ ràng, gây khó khăn trong việc xác định tính sạch và khả năng nảy mầm Trong quá trình nghiên cứu, nhiều yếu tố bất lợi đã xuất hiện, đặc biệt là việc chưa xác định được môi trường tối ưu cho sự phát triển của hạt sâm Hơn nữa, tỷ lệ mẫu không đồng đều và sự hao hụt trong quá trình khử mẫu đã ảnh hưởng đến số lượng hạt, làm giảm hiệu quả thực hiện thí nghiệm.
Cây sâm là loại cây lâu năm nhưng có thời gian phát triển ngắn, do đó hạt sâm không thể ra rễ, khiến việc nghiên cứu về chúng vẫn đang tiếp tục Xuất xứ từ Hàn Quốc, việc nhập khẩu cây sâm vào Việt Nam đòi hỏi một quá trình dài để xác định môi trường và điều kiện phù hợp nhất cho sự phát triển của cây.
Hiện nay thì vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu thành công nuôi cấy hạt sâm trong Invitro
Khảo sát đánh giá các chỉ tiêu của cây sâm bao gồm việc phân tích mẫu nhiễm nấm, mẫu nhiễm khuẩn, mẫu sạch, chiều cao cây và trọng lượng tươi của cây Những chỉ tiêu này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định chất lượng và sự phát triển của cây sâm.
Nghiên cứu cho thấy nồng độ TCCA trong nghiệm thức 5 mang lại hiệu quả khử trùng tốt nhất, tiếp theo là nghiệm thức 4, 3 và 2 Trong khi đó, nghiệm thức 1 ghi nhận mẫu bị nhiễm nặng nhất trong tất cả các nghiệm thức.
Kết quả cho thấy bịch lột vỏ mẫu nhiễm ít hơn bịch không lột vỏ và nồng độ TCCA còn cao thì mức độ nhiễm càng giảm
Chỉ tiêu đánh giá trong nghiên cứu bao gồm mẫu nhiễm nấm, nhiễm khuẩn và mẫu sạch, trong khi chiều cao và trọng lượng của cây vẫn đang được theo dõi Qua thí nghiệm, mẫu không bị nhiễm và không có hiện tượng nứt phôi ra rễ, cho thấy cần thời gian để nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của hạt sâm.
Hạt sâm sẽ được tiếp tục tách phôi và được nhân giống trong nuôi cấy Invitro
Sử dụng một số các chất kích thích sinh trưởng khác nhau tạo điều kiện cho sự sinh trưởng của hạt sâm
KẾT QUẢ NUÔI CẤY HẠT THANH MAI:
Cấy ngày 17/02 sau đó ngày 21/02
Kiểm tra mẫu lần 1: Đối với hạt thanh mai đực khử trùng bằng TCCA:
NT1 (đối chứng): trong 21 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 5 hạt bị nhiễm nấm mốc,
5 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại mẫu sạch 11 hạt
NT2 (ngâm hạt trong 24h): trong 21 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 5 hạt nhiễm nấm mốc, 4 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại mẫu sạch 12 hạt
NT3 (ngâm hạt trong 48h): trong 21 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 4 hạt nhiễm nấm mốc, 4 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại mẫu sạch 13 hạt
NT4 (ngâm hạt trong 72h): trong 21 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 3 hạt nhiễm nấm mốc, 3 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại mẫu sạch 15 hạt
Bảng 3 Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt thanh mai đực xử lý bằng TCCA NGHIỆM THỨC NHIỄM NẤM
Biểu đồ 3 Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt thanh mai đực xử lý bằng TCCA Đối với hạt thanh mai đực khử trùng bằng Javen:
NT1 (đối chứng): trong 21 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 6 hạt bị nhiễm nấm mốc,
5 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại mẫu sạch 10 hạt
NT2 (ngâm hạt trong 24h): trong 21 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 5 hạt nhiễm nấm mốc, 5 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại mẫu sạch 11 hạt
NT3 (ngâm hạt trong 48h): trong 21 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 7 hạt nhiễm nấm mốc, 5 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại mẫu sạch 9 hạt
NT4 (ngâm hạt trong 72h): trong 21 hạt cho cả 3 lần lặp thì có 7 hạt nhiễm nấm mốc, 6 hạt bị nhiễm khuẩn còn lại mẫu sạch 8 hạt
Bảng 4 Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt thanh mai đực xử lý bằng Javen
Biểu đồ 4 Mức độ nhiễm nấm và khuẩn của nghiệm thức hạt thanh mai đực xử lý bằng Javen
Kiểm tra mẫu lần 2: (ngày 27/2) hầu hết tất cả các nghiệm thức không bị nhiễm nấm và khuẩn và không có hiện tượng gì khác thường
Trong lần kiểm tra mẫu thứ ba vào tháng 3, không phát hiện hiện tượng bất thường nào trong các thí nghiệm mẫu hạt thanh mai Các mẫu cũng không bị nhiễm nấm hay vi khuẩn.
Riêng nghiệm thức đối chứng xảy ra hiện tượng nâu hóa Do mẫu tiết phenol
Hình 20: Mẫu hạt thanh mai bị phenol hóa
Giải pháp hiệu quả để cải thiện môi trường nuôi cấy là cấy vào một môi trường khác và bổ sung than hoạt tính Than hoạt tính có khả năng hấp phụ các chất độc hại, giúp hạn chế sự tiết phenol và hiện tượng hóa nâu, từ đó nâng cao chất lượng kết quả nuôi cấy.
Than hoạt tính có khả năng hấp phụ cả các chất không mong muốn lẫn hormone, vitamin và ion kim loại như Cu2+ và Zn2+, dẫn đến việc giảm sự tăng trưởng chồi của Gymnema sylvestre và hạn chế chiều cao chồi của Anacardium occidentale Trong một số trường hợp, nó không thể ngăn chặn hiện tượng hóa nâu ở mô sẹo Plumbago zeylanica, mặc dù có thể làm giảm quá trình này nhưng lại cản trở sự biệt hóa mô Do đó, trong nuôi cấy hạt thanh mai, chỉ nên sử dụng một lượng nhỏ than hoạt tính, khoảng 0,1g/l, bổ sung vào môi trường 1/2 MS.
Vào ngày 6/4, trong lần kiểm tra mẫu thứ 4, đã phát hiện hiện tượng nứt rễ ở hạt thanh mai tại miệng hạt trong các nghiệm thức 3, 4 và 5, áp dụng cho cả hai chất thí nghiệm khử trùng TCCA và Javen.
NT1 (đối chứng): vẫn không thấy hiện tượng gì ở hạt thanh mai
NT2 (ngâm hạt trong 24h): thấy trên miệng hạt nứt ra nhô lên 1 ít rễ có 10 hạt nhô ra trong 42 hạt
NT3 (ngâm hạt trong 48h): thấy trên miệng hạt nứt ra nhô lên 1 ít rễ có 17 hạt nhô ra trong 42 hạt
NT4 (ngâm hạt trong 72h): thấy trên miệng hạt nứt ra nhô lên 1 ít rễ có 20 hạt nhô ra trong 42 hạt
Hình 21 Mẫu hạt thanh mai nhô ra rễ Bảng 5 Tỷ lệ số hạt thanh mai nứt rễ NGHIỆM THỨC SỐ HẠT NỨT RỄ PHẦN TRĂM (%)
Biểu đồ 5 Tỷ lệ số hạt thanh mai nứt rễ
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hạt thanh mai khi được ngâm trong nước cất trong khoảng thời gian 24h, 48h và 72h sẽ xuất hiện hiện tượng rễ nhô ra Ngược lại, trong nghiệm thức đối chứng, hạt không có bất kỳ sự phát triển nào Điều này xảy ra do hạt thanh mai có một lỗ thông nhỏ ở đầu, cho phép nước thẩm thấu vào bên trong, kích thích nội nhũ phình ra và tạo điều kiện cho rễ phát triển qua lỗ thông này.
Hiện nay, hạt thanh mai vẫn đang trong giai đoạn nứt vỏ và mới nhú rễ Thời gian sinh trưởng lâu dài của hạt này là do thanh mai là cây rừng lâu năm, phát triển tốt trong tự nhiên nhưng cần thời gian dài để hoàn thiện khi nuôi cấy trong môi trường nhân tạo Xuất xứ từ vùng hoang dã Hy Mã Lạp Sơn Ấn Độ, việc nghiên cứu cây thanh mai ở nước ta hiện còn nhiều hạn chế.
Hiện nay, tôi đang tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện chuyên đề về cây thanh mai Cây thanh mai, là một loại cây rừng, phát triển tốt trong môi trường tự nhiên Tuy nhiên, quá trình nhân giống cây thanh mai từ hạt trong điều kiện tự nhiên diễn ra khá chậm.
Theo kết quả trên thì ta thấy nồng độ khử trùng cảu TCCA có hiệu quả cao hơn so với Chất khử trùng Javen
