Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát một số hoạt tính sinh học của loài Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm. và Kadsura coccinea (Lem.) A. C. Sm. ở Việt Nam.

Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát một số hoạt tính sinh học của loài Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm. và Kadsura coccinea (Lem.) A. C. Sm. ở Việt Nam. Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát một số hoạt tính sinh học của loài Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm. và Kadsura coccinea (Lem.) A. C. Sm. ở Việt Nam. Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát một số hoạt tính sinh học của loài Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm. và Kadsura coccinea (Lem.) A. C. Sm. ở Việt Nam. Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát một số hoạt tính sinh học của loài Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm. và Kadsura coccinea (Lem.) A. C. Sm. ở Việt Nam. Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát một số hoạt tính sinh học của loài Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm. và Kadsura coccinea (Lem.) A. C. Sm. ở Việt Nam.

Hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO)

Fang và cộng sư đã phân lập được 5 spirobenzofuranoid dibenzocyclooctadiene lignan từ cặn ethyl acetate của rễ cây K.coccinea, gồm schiarisanrin B (144), heteroclitin D (145) kadsulignan H-I (146-147), và schiarisanrin A (148) [46].

Li và cộng sư cũng công bố sư xuất hiện của kadsulignan E (149) và F (150) trong một nghiên cứu từ rễ của cây Na rừng [47].

Li và cộng sự đã tách chiết thành công hợp chất kadsuralignan C (151) từ dịch chiết chloroform của thân cây Na rừng, đánh dấu đây là hợp chất đầu tiên trong nhóm này được ghi nhận.

Yeon và cộng sư thu được (7′S,8′S,8R)-(8β,8′α)-dimethyl-4,4′-dihydroxy-5,3′- dimethoxy-5′-cyclolignan glucoside (152) [49].

Năm 2007, nhóm nghiên cứu của Li đã phân lập được kadsuralignan H (153) từ cặn chiết ethyl acetate của rễ cây Na rừng [42].

Nhóm nghiên cứu của Fang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất Kadsurindutin E (154), Coccilignan A (155) và Meso-dihydroguaiaretic acid (156) từ cặn chiết ethyl acetate của rễ cây Na rừng Ngoài ra, hợp chất Kadcoccilignan (157) cũng được công bố bởi Gao và cộng sự vào năm 2012.

Bảng 1.6 Các lignan phân lập từ loài Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.

Tên chất Ký hiệu TLTK Tên chất Ký hiệu TLTK

Kadsulignan H 146 Kadcoccilignan 157 [40] d Các hợp chất khác

Ngoài thành phần chính là terpeneoid, lignan, flavonoid, trong cây Na rừng còn chứa một số hợp chất khác như β-sitosterol (158) và β-sitosteryl-3-O-β-D- glucopyranoside (159) [39].

1.4.2.2 Các nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, năm 2009, nhóm nghiên cứu của Ninh Khắc Bản và cộng sư đã phân lập được một hợp chất 3,4-seco-lanostane triterpenoid là seco-coccinic acid F

(119) và 1 hợp chất đã biết là 20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta-7,24-dien-26-oic acid (130) từ cặn chiết methanol từ rễ cây Na rừng [39].

Trong một báo cáo tại Hội nghị khoa học ở Việt Nam năm 2009, các nhà khoa học đã chiết xuất tinh dầu từ rễ cây Na rừng ở Tràng Định, Lạng Sơn và xác định thành phần hóa học của chúng Kết quả nghiên cứu cho thấy có 36 hợp chất được tìm thấy trong tinh dầu rễ cây Na rừng, bao gồm các hợp chất như α-pinene, camphene, α-terpeniol, β-caryophyllene, 1,2,3-trimethyl, và β-himachalene.

Các hợp chất và dịch chiết từ cây Na rừng đã cho thấy nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý, bao gồm khả năng gây độc tế bào, kháng HIV, chống viêm gan, chống oxy hóa và tác dụng bảo vệ thần kinh.

1.4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào

Hợp chất kasuracin A có tác dụng chống tăng sinh mạnh mẽ, với giá trị IC50 dao động từ 1,05 đến 11,31 µg/mL trên bốn dòng tế bào ung thư người, bao gồm HCT116, A549, HL-60 và HepG2.

Hợp chất heilaohulignan C đã chứng minh có hoạt tính gây độc tế bào tốt trên dòng tế bào ung thư HepG-2 ở người với giá trị IC50 là 9,92 µg/mL, theo báo cáo của Liu và cộng sự Ngoài ra, các hợp chất seco-coccinic acid F, G và K cũng cho thấy tác dụng ức chế sự tăng sinh tế bào trên dòng tế bào bạch cầu HL-60 ở người với giá trị GI50 lần lượt là 16,6; 15,2 và 28,4 µM.

Kadlongilactone A-B và longipedlactone A được báo cáo là thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào K562, Bel-7402 và A549 với IC50 lần lượt là 0,1; 0,1 và 1,0 àM.

Kadcoccinone A-F đã được chứng minh có hoạt tính gây độc tế bào trên 6 dòng tế bào ung thư người, bao gồm HL-60, SMMC7721, A-549, MCF-7, SW-480 và HeLa Nghiên cứu về mối liên quan cấu trúc - tác dụng của kadcoccinone A và B cho thấy sự phân cắt và phản ứng hemiketal giữa C-12 và C-14 có thể làm giảm hoạt tính gây độc tế bào Đồng thời, kadcoccinone E thể hiện độ độc tính cao hơn kadcoccinone D, cho thấy cấu hình 23S,24R của nhóm epoxy làm tăng hoạt tính so với cấu hình 23R,24S.

Liang và cộng sư đã công bố về hoạt tính kháng HIV của kadcotrione A và C với

EC50 của các hợp chất như kadcoccitone B và 12β-hydroxycoccinic acid lần lượt là 30,29 và 54,81 àg/mL, cho thấy hoạt tính kháng HIV Nghiên cứu của Liu cũng chỉ ra rằng kadsulignan M có hoạt tính kháng HIV với IC50 1,19 x 10-4 M và EC50 6,03 x 10-6 M Cấu trúc của kadsulignan M cho thấy nhóm benzoyl ở C-6 và nhóm hydroxyl ở C-7 có vai trò quan trọng trong việc tăng cường khả năng kháng HIV Thêm vào đó, các nhóm 2,3-methylenedioxy và 12,13-dimethoxy trên vòng thơm cũng góp phần làm tăng hoạt tính kháng HIV.

1.4.3.3 Hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO)

Hu và cộng sự đã công bố khả năng ức chế sản xuất NO từ cặn chiết ethyl acetate của thân rễ cây Na rừng Ngoài ra, từ các phân đoạn trong cặn chiết ethyl acetate, họ đã phân lập được dibezocyclooctadiene lignan, cụ thể là kadsuraligan G-L, có hoạt tính ức chế sinh NO ở mức độ trung bình.

Fang và cộng sự đã tiến hành đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO do LPS gây ra trên tế bào BV-2 từ một số hợp chất phân lập được từ loài thực vật Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất acetylschisantherin L, schiarisanrin B, heteroclitin D, kadsulignan H-I và schiarisanrin A có khả năng ức chế mạnh mẽ sản sinh NO trong tế bào BV-2 của chuột.

Hoạt tính khác

Ninh Khắc Bản và cộng sự đã báo cáo rằng các hợp chất acetylepigomisin R, isovaleroylbinankadsurin A và binankadsurin A, được phân lập từ cây Na rừng, cho thấy hoạt tính bảo vệ tế bào gan chuột khỏi tổn thương do t-butyl hydroperoxide với giá trị ED50 lần lượt là 135,7; 26,1 và 79,3 àM Myeong-Jin Goh và cộng sự đã công bố khả năng ức chế tổng hợp melanin của hợp chất kadsuralignan F thông qua việc ức chế enzyme tyrosinase Sun và cộng sự đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của quả cây Na rừng bằng phương pháp DPPH, kết quả cho thấy các phenolic acid có hoạt tính chống oxy hóa đáng kể Kadcoccinin A-B được đánh giá về khả năng kháng nấm, nhưng cả hai đều cho hoạt tính yếu và không đáng kể.

Loài Thông đất và Na rừng có thành phần hóa học phong phú và nhiều hoạt tính sinh học thú vị, đặc biệt là khả năng gây độc tế bào và ức chế sản sinh NO Mặc dù có nhiều công bố quốc tế về hai loài này, nhưng các nghiên cứu tại Việt Nam vẫn còn hạn chế Do đó, việc nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và hoạt tính của chúng sẽ góp phần làm sáng tỏ cơ sở khoa học cho công dụng trong y học cổ truyền và nâng cao giá trị của các loài dược liệu này.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Loài Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.)

Vào tháng 3 năm 2017, toàn bộ thân cây Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.) đã được thu hái tại Sapa, Lào Cai, Việt Nam Mẫu thực vật này được định danh bởi TS Nguyễn Thế Cường từ Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST) Mẫu tiêu bản, mang mã NCCBG.01.20, hiện đang được lưu trữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, VAST.

2.1.2 Loài Na rừng (Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.)

Lá cây Na rừng (Kasura coccinea (Lem.) A C Smith) được thu hái vào tháng 5 năm 2017, trong khi thân cây được thu hái vào tháng 5 năm 2018 tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc Mẫu thực vật này đã được định danh bởi PGS TS Trần Huy Thái, thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST) Hai mẫu tiêu bản (KC201705 và KC201805) hiện đang được lưu trữ tại Viện Kỹ thuật Hóa học, Đại học Bách Khoa Hà Nội.

*Nguồn ảnh từ đề tài Nafosted mã 104.01-2018.07

*Nguồn ảnh từ đề tài Nafosted mã 104.01-2019.318

Hình 2.1 Mẫu các loài thực vật

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập chất

Sắc ký cột (CC) là một phương pháp phân tách hiệu quả, được thực hiện trên các loại silica gel như Kieselgel 60, 70–230 mesh và 230–400 mesh từ Merck, cũng như silica gel pha đảo YMC (ODS-A, 12 nm, S-150 mm) từ YMC Co., Ltd., Nhật Bản Bên cạnh đó, gel polyme xốp Diaion® HP-20 (20–60 mesh) của Mitsubishi cũng được sử dụng trong quy trình này, mang lại hiệu suất tách chiết tối ưu.

Chemical, Tokyo, Japan), nhưa Sephadex ™ LH-20 (GE Healthcare Bio-Sciences

AB, Uppsala, Thụy Điển) và YMC RP-18 (30–50 àm, Fuji Silysia Chemical).

Sắc ký lớp mỏng (TLC) sử dụng các tấm silica gel 60 F254 và RP-18 F254S của Merck để phân tích chất Quy trình phát hiện chất được thực hiện bằng cách phun dung dịch H2SO4 10% lên bề mặt và sau đó đun nóng trong khoảng 1,5-2 phút.

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các chất

Cấu trúc các hợp chất phân lập được xác định dưa vào các thông số vật lý kết hợp với các phương pháp phổ hiện đại.

2.2.2.1 Góc quay cực riêng của một hợp chất quang hoạt chứa các trung tâm bất đối, được đo trên máy JASCO P-2000 Polarimeter (Tokyo, Nhật Bản) tại Viện Hóa sinh biển, VAST.

Phổ HR-ESI-MS là công nghệ phân tích khối lượng phân giải cao, cho phép xác định chính xác các ion mảnh hoặc phân tử Phân tích được thực hiện trên máy khối phổ Agilent 6530 Accurate-Mass tại Viện Hóa học, VAST.

2.2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ NMR được đo bằng máy Bruker AVANCE III HD 500 (Brucker, Đức) và Bruker AVANCE III HD 500 (MA, Mỹ) FT-NMR tại Viện Hóa học, VAST, cùng với máy đo phổ JEOL JNM-AL 400 MHz Chất nội chuẩn sử dụng trong phân tích là TMS (Tetramethyl silane).

- Các kỹ thuật phổ NMR được sử dụng bao gồm:

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1 H-NMR, 13 C-NMR.

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMQC, HMBC, 1 H- 1 H COSY, NOESY.

Dung môi được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm DMSO-d 6, methanol-d 4, chloroform-d 1 và pyridine-d 5 Việc lựa chọn dung môi phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, với nguyên tắc là dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu đo.

2.2.2.4 Phổ lưỡng sắc tròn (CD)

Phổ CD cho phép xác định cấu trúc tuyệt đối của các hợp chất phân lập từ tự nhiên có các trung tâm carbon bất đối Việc đo đạc được thực hiện trên máy Chirascan spectrometer (Applied Photophysics, Vương quốc Anh) tại Viện Hóa sinh biển, VAST.

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.2.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào và ức chế sinh trưởng tế bào ung thư

Nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các mẫu dịch chiết và chất sạch được thực hiện trên các dòng tế bào ung thư như HepG2 (ung thư gan), SK-Mel-2 (ung thư da melanoma) và MCF7 (ung thư vú) tại phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư đã được nghiên cứu trên các dòng tế bào HCT-15 (ung thư đại tràng), NUG-3 (ung thư dạ dày), NCI-H23 (ung thư phổi), ACHN (ung thư thận), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt) và MDA-MB-231 (ung thư vú) Nghiên cứu này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm hóa học các sản phẩm tự nhiên biển, Viện Khoa học và Công nghệ Đại dương Hàn Quốc, Busan, Hàn Quốc.

- FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma)

- Đĩa 96 giếng nhưa (Corning, USA), pipette, eppendorf, máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-Rad), đầu đọc vi tấm VersaMax (LLC, Sunnyvale, CA, USA)

- Chất tham khảo: Ellipticine (Sigma, USA), adriamycin (Sigma, USA).

- Các hóa chất thông thường khác

- Các dòng tế bào ung thư do GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và

GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia và American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) cung cấp.

 Nguyên lý của phép thử [56]:

Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa

Kỳ (Viện Ung thư Quốc gia - NCI) xác nhận rằng đây là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc và phát hiện các chất có khả năng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt tế bào ung thư trong điều kiện in vitro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks.

Phép thử xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dưa thông qua mật độ quang học (OD) được đo khi protein tế bào được nhuộm bằng sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein; do đó, khi số lượng tế bào và lượng protein tăng lên, giá trị OD cũng tăng theo Thí nghiệm này được thực hiện trong các điều kiện cụ thể.

Các mẫu thử nghiệm được hòa tan trong DMSO và chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau (0,5; 2; 10; 20 và 40 μM) thông qua quá trình pha loãng phù hợp với môi trường tăng trưởng.

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

Chất thử (10 àL) được pha vào các nồng độ khác nhau trong các giếng của đĩa 96 giếng, sau đó thêm 190 àL tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp vào các giếng này Mục tiêu là đạt được nồng độ chất thử trong giếng là 100 àg/mL, 20 àg/mL, 4 àg/mL và 0,8 àg/mL.

Ủ trong tủ ấm trong 48 giờ, không có chất thử nhưng sử dụng TBUT (190 àL) làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng trichloracetic acid 50% (50 àg/mL) – TCA.

- Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB 0.4% trong 30 phút ở 37 o C, rửa 3 lần bằng acetic acid 1% rồi để khô ở nhiệt độ phòng.

- Thuốc nhuộm liên kết với protein được chiết với base Tris 10 mM ở pH 10,5 để xác định mật độ quang học.

- Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy đọc ELISA (Bio-Rad) và đầu đọc vi tấm VersaMax.

- Phần trăm ức chế sư phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

% ức chế = 100% - [OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100

OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0)

- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác.

Ellipticine được sử dụng ở các nồng độ 10 µg/mL, 2 µg/mL, 0,4 µg/mL và 0,08 µg/mL như là chất đối chứng dương trong thử nghiệm gây độc tế bào Trong khi đó, adriamycin được sử dụng làm chất đối chứng dương trong thử nghiệm ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

THỰC NGHIỆM

Phân lập các hợp chất từ loài Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.) 31 1 Quy trình phân lập các chất

3.1.1 Quy trình phân lập các chất

Sau khi thu hoạch, toàn cây Thông đất được rửa sạch, phơi khô và nghiền nhỏ, thu được 5,2 kg bột dược liệu khô Bột này được ngâm chiết với methanol ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, với 3 lần chiết mỗi lần 10 L Dịch chiết methanol sau đó được cô quay, thu được 360 g cặn chiết tổng Cặn chiết này được hòa vào 2 L nước và tiếp tục chiết phân bố lần lượt bằng n-hexane, ethyl acetate, và cuối cùng là cô quay dưới áp suất giảm để thu được các cặn chiết n-hexane (H), cặn chiết ethyl acetate (E) và dịch chiết nước (W) Sơ đồ ngâm chiết được thể hiện trên hình 3.1.

Hình 3.1 Sơ đồ ngâm chiết thân cây Thông đất

Dịch nước được phân tách trên cột Diaion HP-20 và rửa giải với hệ dung môi

MeOH/nước với tỷ lệ lần lượt là 100/1; 50/50 và 100/0) thu được 3 phân đoạn W1- 3.

Phân đoạn W2 (3,2 g) đã được tách ra bằng phương pháp sắc ký cột pha đảo RP18 với hệ dung môi MeOH/nước (tỉ lệ 1/2 đến 2/1), cho ra 4 phân đoạn nhỏ là W2A, W2B, W2C và W2D Hợp chất LC1 (1,0 mg) được chiết xuất từ phân đoạn W2A thông qua sắc ký cột pha đảo RP18 với dung môi MeOH/acetone/H2O (tỉ lệ 8/1/1) và sau đó được xử lý qua cột Sephadex™ LH-20.

Phân đoạn W2C được chạy sắc ký cột pha thường với hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH/acetone/H2O (6/5/0,04/0,1) thu được 3 phân đoạn nhỏ W2C1-W2C3.

Hợp chất LC18 (3,0 mg) được tinh chế từ phân đoạn W2C1 bằng phương pháp sắc ký trên cột silica gel pha thường Hệ dung môi sử dụng để rửa giải là EtOAc/MeOH/H2O với tỷ lệ 7/1/0,1 Sau đó, hợp chất này tiếp tục được tinh chế qua cột SephadexTM LH-20 bằng hệ dung môi MeOH/H2O với tỷ lệ 1/1.

Phân đoạn W2C3 (150 mg) được tách ra bằng phương pháp sắc ký cột pha thường sử dụng hệ dung môi EtOAc/MeOH/H2O (7/1/0,1) và sắc ký cột pha đảo RP18 với hệ dung môi MeOH/H2O (1/3 và 1/2), từ đó thu được các hợp chất LC19 (4,0 mg), LC20 (13,0 mg) và LC2 (4,0 mg) Đối với phân đoạn W2D (640,0 mg), quá trình tách chiết cũng được thực hiện thông qua sắc ký cột pha thường với hệ dung môi phù hợp.

CH2Cl2/MeOH/acetone/H2O (6,5/1/0,04/0,1) và cột Sephadex™ LH-20 rửa giải bằng hệ dung môi MeOH/acetone/H2O (8/1/1) thu được hợp chất LC3 (3,0 mg) và

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập dịch nước của cây Thông đất

Cặn chiết Ethyl acetate (60 g) được tách thành 4 phân đoạn nhỏ E1-E4 thông qua phương pháp sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexane/EtOAc (10/1 đến 0/1) Phân đoạn E3 (30 g) sau đó được tiếp tục sắc ký cột pha thường sử dụng hệ dung môi n-hexane/EtOAc (20/1 đến 1/1), từ đó thu được 4 phân đoạn nhỏ E3A-E3D.

Tinh chế phân đoạn E3B (7,0 g) trên cột sắc ký pha đảo RP18 hệ dung môi acetone/H2O (4/3) thu được hợp chất LC6 (2,5 mg) và LC12 (9,0 mg).

Phân đoạn E3C (14,0 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo hệ dung môi MeOH/H2O (1/1) và tinh chế thêm trên cột sắc ký pha thường hệ dung môi

CH2Cl2/acetone (6/1) thu được các hợp chất LC5 (10,0 mg); LC7 (2,0 mg); LC8 (4,0 mg) và LC9 (5,0 mg);

Tinh chế phân đoạn E3D (2,8 g) trên cột sắc ký pha đảo RP18 hệ dung môi acetone/H2O (1/3) và tinh chế thêm trên cột silica gel pha thường hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH (20/1) thu được hợp chất LC16 (10,0 mg) và LC17 (5,0 mg)

Tiến hành sắc ký cột pha thường phân đoạn E4 (15g) hệ dung môi n- hexane/EtOAc (6/1 đến 1/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ E4A-E4D.

Tinh chế phân đoạn E4A (1,4 g) được thực hiện trên sắc ký cột pha đảo RP18 với hệ dung môi MeOH/H2O (8/1) và cột Sephadex™ LH-20 sử dụng hệ MeOH/H2O (1/1), thu được các hợp chất LC10 (10,0 mg), LC11 (50,0 mg), LC13 (15,5 mg) và LC14 (5,0 mg).

Phân đoạn E4D (1,0 g) được tinh chế thông qua sắc ký cột pha đảo RP18 sử dụng hệ dung môi acetone/H2O Sau đó, quá trình tiếp tục bằng sắc ký cột pha thường, được rửa giải bằng hệ dung môi.

CH2Cl2/MeOH (15/1) thu được hợp chất LC15 (6,0 mg).

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập cặn EtOAc của cây Thông đất 3.1.2 Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ loài Thông đất

3.1.2.1 Hợp chất LC1: Lycocernuaside E (hợp chất mới)

KLPT chính xác (tính toán) [C25H32O12Cl]-:

559,1588 Công thức phân tử: C25H32O12, Mw = 524 g/mol

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.1

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.2

3.1.2.3 Hợp chất LC3: Bombasin 4-O-β-D-glucopyranoside

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.3

3.1.2.4 Hợp chất LC4: Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D- glucopyranoside

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.4

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.5

3.1.2.6 Hợp chất LC6: Lycernuic B (hợp chất mới)

Góc quay cưc riêng: − 54.3 (c 0,04, MeOH)

KLPT chính xác (tính toán) [C37H55O6]-:

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.6

3.1.2.7 Hợp chất LC7: Lycocernuic ketone F (hợp chất mới)

Góc quay cưc riêng: − 31,6 (c 0,1; MeOH).

KLPT chính xác (tính toán) [C30H49O4]+:

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.7

3.1.2.8 Hợp chất LC8: Lycernuic ketone C

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ): xem Bảng

3.1.2.9 Hợp chất LC9: Lycernuic ketone B

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.9

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ): xem Bảng 4.1.10

3.1.2.11 Hợp chất LC11: 3-epi-lycoclavanol

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ): xem Bảng

3.1.2.12 Hợp chất LC12: Methyl lycernuate B

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ): xem Bảng

3.1.2.13 Hợp chất LC13: Lycernuic acid B

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ): xem Bảng

3.1.2.14 Hợp chất LC14: 3β,21β,24-trihydroxyserrat-14-en-16-one

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ): xem Bảng 4.1.14

3.1.2.15 Hợp chất LC15: Apigenin-4′-O-(2′′-O-p-coumaroyl)-β-D- glucopyranoside

Chất bột màu vàng

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.15

3.1.2.16 Hợp chất LC16: Apigenin-4′-O-(6′′-O-p-coumaroyl)-β-D- glucopyranoside

Chất bột màu vàng

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ): xem Bảng

3.1.2.17 Hợp chất LC17: Apigenin-4′-O-(2′′,6′′-di-O-trans-p-coumaroyl)-β-D- glucopyranoside

Chất bột màu vàng nhạt

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) xem Bảng

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.18

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD):xem Bảng 4.1.19

3.1.2.20 Hợp chất LC11: Cermizine C N-Oxide

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.20

Phân lập các chất từ loài Na rừng (Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.)

3.2.1 Quy trình phân lập chất

Sau khi thu hoạch, thân cây Na rừng được rửa sạch, phơi khô, chặt nhỏ và nghiền thành 5,5 kg bột khô Bột này sau đó được chiết xuất bằng methanol 80% (6 L, thực hiện 3 lần) ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Dịch chiết methanol được cô quay dưới áp suất giảm để thu được sản phẩm.

Cặn chiết 320 g được hòa vào 2 L nước và chiết phân bố lần lượt với n-hexane (1 L x 3 lần), ethyl acetate (1 L x 3 lần), phần còn lại là nước Các dịch chiết sau đó được cô quay dưới áp suất giảm để thu được các cặn chiết tương ứng, trong đó có cặn H.

Phân đoạn ethyl acetate được tách ra bằng phương pháp sắc ký cột pha thường với chất hấp phụ silica gel Quá trình rửa giải sử dụng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH với tỷ lệ từ 0% đến 100%, cho ra 12 phân đoạn nhỏ được đánh số từ KCE1 đến KCE12, dựa trên dữ liệu sắc ký bản mỏng của các phân đoạn này.

Phân đoạn KCE3 (7,5 g) đã được thực hiện sắc ký cột pha đảo RP18, sử dụng hệ rửa giải acetone/MeOH/nước (1/1/1,5) và thu được 6 phân đoạn nhỏ từ KCE3A đến KCE3F Trong đó, phân đoạn KCE3B (320 mg) được tinh chế trên cột Sephadex LH-20 và rửa giải bằng methanol, cho ra hợp chất KC13 (5,6 mg).

Phân đoạn KCE3D (550 mg) được sắc ký cột pha thường rửa giải hệ

CH2Cl2/EtOAc (5/1) thu được hợp chất KC15 (6,1 mg).

Phân đoạn KCE3F (625 mg) được tinh chế trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexane/acetone (4/1) thu được hợp chất KC14 (7,1 mg).

Phân đoạn KCE5 (200 mg) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP18, rửa giải bằng acetone/H2O (1,2/1) để thu được hợp chất KC1 (5,8 mg).

Sắc ký cột pha đảo RP18 phân đoạn KCE6 (8,3 g) được rửa giải bằng hệ dung môi MeOH/H2O (1,5/1), tạo ra 5 phân đoạn nhỏ (KCE6A - KCE6E) Trong đó, phân đoạn KCE6B (350 mg) được tinh chế thêm bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi EtOAc/acetone (3/1,2), thu được KC2 (8,5 mg) và KC3 (5,5 mg) Hợp chất KC4 (6,2 mg) được chiết xuất từ phân đoạn KCE6E (320 mg) thông qua sắc ký cột RP18 và rửa giải bằng hệ dung môi acetone/H2O (1,3/1).

Như vậy, từ thân cây Na rừng đã phân lập được 7 hợp chất, từ KC1-KC4 và

Hình 3.4 Sơ đồ phân lập chất từ thân cây Na rừng 3.3.1.2 Từ lá cây

Lá cây Na rừng sau khi thu thập được rửa sạch, phơi khô và nghiền nhỏ, thu được 3,5 kg bột khô Bột khô này được chiết xuất với 95% methanol (4L × 4 lần) ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Dịch chiết MeOH sau đó được làm khô dưới áp suất giảm, thu được 125 g cặn chiết Cặn chiết này được hòa vào nước (2 L) và được chiết phân bố lần lượt với n-hexane (1 L × 3 lần, 78 g), CH2Cl2 (1 L × 4 lần, 11 g) và lớp H2O.

Phân đoạn CH2Cl2 (11 g) được tách bằng sắc ký cột silica gel với dung môi MeOH/CH2Cl2 (từ 0-100%), thu được 8 phân đoạn nhỏ (KCB1 ‒ KCB7) Phân đoạn KCB5 (0,2 g) được tinh chế trên cột Sephadex LH-20 với dung môi MeOH/H2O (1/1), thu được KC5 (4,5 mg).

Phân đoạn KCB6 (1,2 g) được tách chiết bằng phương pháp sắc ký cột pha thường, sử dụng dung môi n-hexane/CH2Cl2/MeOH/H2O (1/3/1) để rửa giải Sau đó, tinh chế thêm trên sắc ký cột pha đảo RP18 với hệ dung môi acetone/H2O (1/1,8) đã thu được KC6 với khối lượng 4,3 mg.

Lớp H2O được phân tách trên cột Diaion HP-20 bằng hệ dung môi MeOH trong nước (từ 0% đến 100%) thu được bảy phân đoạn (KCC1 ‒ KCC7).

Hợp chất KC7 (2,7 mg) và KC8 (6,3 mg) thu được từ sắc ký cột pha đảo RP18 phân đoạn KCC2 (0,35 g) hệ dung môi acetone/H2O (1/2,5).

Phân đoạn KCC3 (0,16 g) được tách chiết bằng sắc ký cột pha thường với dung môi EtOAc/MeOH/H2O (5/1/0,02), thu được hợp chất KC11 (5,2 mg) Trong khi đó, phân đoạn KCC4 (0,86 g) được phân tách trên cột silica gel với dung môi CH2Cl2/MeOH (7/1) và tinh chế thêm trên Sephadex LH-20 bằng dung môi MeOH/H2O (1/1), cho ra hợp chất KC10 (5,9 mg).

Hợp chất KC9 (4,5 mg) thu được từ phân đoạn KCC5 (0,72 g) trên sắc ký cột pha đảo RP18 rửa giải bằng hệ dung môi acetone/H2O (1/1,6).

Phân đoạn KCC6 (1,08 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP18 với hệ dung môi acetone/H2O (1/1,2) để thu được hợp chất KC12 (6,3 mg).

Như vậy, từ lá cây Na rừng đã phân lập được 8 hợp chất, từ KC5-KC12.

Hợp chất KC1, được biết đến với tên gọi Kadnanolactone H, đã được phân lập từ lá cây Na rừng Trong phần này, chúng tôi sẽ trình bày thông số vật lý và dữ liệu phổ của hợp chất này, cung cấp cái nhìn sâu sắc về cấu trúc và tính chất của nó Sơ đồ phân lập chất từ lá cây Na rừng sẽ được sử dụng để minh họa quá trình tách chiết.

1H-NMR (400 MHz, pyridine-d 5 ) và 13C-NMR (100 MHz, pyridine-d 5 ): xem Bảng 4.2.1.

1H-NMR (400 MHz, pyridine-d 5 ) và 13C-NMR (100 MHz, pyridine-d 5 ): xem Bảng 4.2.2.

3.2.2.3 Hợp chất KC3: Kadcoccilactone V (hợp chất mới)

KLPT chính xác (tính toán) [C29H41O9]+:

1H-NMR (400 MHz, pyridine-d 5 ) và 13C-NMR(100 MHz, pyridine-d 5 ): xem Bảng 4.2.3.

1H-NMR (400 MHz, pyridine-d 5 ) và 13C-NMR (100 MHz, pyridine-d 5 ): xem Bảng 4.2.4.

3.2.2.5 Hợp chất KC5: Kadsuracin A (hợp chất mới)

KLPT chính xác (tính toán) [C30H34O10NH4]+:

1H-NMR (400 MHz, chloroform-d 1 ) và 13C-NMR (100 MHz, chloroform-d 1 ): xem Bảng

1H-NMR (400 MHz, chloroform-d 1 ) và 13C-NMR (100 MHz, chloroform-d 1 ): xem Bảng

3.2.2.7 Hợp chất KC7: (S)-1-phenylethyl-6-α-L-arabinopyranosyl-β-D- glucopyranoside (hợp chất mới)

Chất dạng dầu không màu

Góc quay cưc riêng: − 60,2 (trong MeOH; c 0,05)

KLPT chính xác (tính toán) [C19H28O10Na]+:

1H-NMR (400 MHz, methanol-d 4 ) và 13C-NMR (100 MHz, methanol-d 4 ): xem Bảng

3.2.2.8 Hợp chất KC8: 3,4-dihydroxyphenylethanol-5-O-β-D-glucose

1H-NMR (400 MHz, methanol-d 4 ) và 13C-NMR (100 MHz, methanol-d 4 ): xem Bảng

Chất dạng dầu không màu

1H-NMR (400 MHz, methanol-d 4 ) và 13C-NMR (100 MHz, methanol-d 4 ): xem Bảng

1H-NMR (400 MHz, methanol-d 4 ) và 13C-NMR (100 MHz, methanol-d 4 ): xem Bảng

1H-NMR (400 MHz, methanol-d 4 ) và 13C-NMR (100 MHz, methanol-d 4 ): xem Bảng

Chất bột màu vàng đỏ

1H-NMR (400 MHz, methanol-d 4 ) và 13C-NMR (100 MHz, methanol-d 4 ): xem Bảng

3.2.2.13 Hợp chất KC13: Seco-coccinic acid A

1H-NMR (400 MHz, pyridine-d 5 ) và 13C-NMR (100 MHz, pyridine-d 5 ): xem Bảng

3.2.2.14 Hợp chất KC14: Seco-coccinic acid F

1H-NMR (400 MHz, pyridine-d 5 ) và 13C-NMR (100 MHz, pyridine-d 5 ): xem Bảng

1H-NMR (400 MHz, chloroform-d 1 ) và 13C-NMR (100 MHz, chloroform-d 1 ): xem Bảng