CHUONG 3 CHUONG 3 PHUONG TIEN PHUONG PHAP
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện: đề tài được thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013.
Địa điểm: phòng thí nghiệm vệ sinh thực phẩm, Bộ môn Thú Y, khoa Nông
nghiệp và Sinh học Ứng dụng — Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Đối tượng thí nghiệm
Heo con bị tiêu chảy tại các hộ chăn nuôi của huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long. Mẫu phân heo tiêu chảy chưa qua điều trị.
3.2 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm
Thùng lấy mẫu, tăm bông, bình cồn, hột quẹt, ống nghiệm lấy mẫu, giấy đo PH, bông gòn, phiếu điều tra, kéo, tủ sấy, tủ ấm, autoclave, may li tâm, máy lắc, máy chạy điện đi, máy PCR, bếp đun cách thủy, buồng cấy vô trùng, cân, dao, kéo, dia petri, ống nghiệm, ống đong, ống hút, chai, que cấy, đèn côn, nhiệt kế, túi nylon, găng tay, khâu trang, đá khô.
3.2.2 Hóa chất, môi trường
Cồn, nước cất, natri clorua, MacConkey Agar (MC; Merck, Germany), Nutrient Agar (NA), Kligler Iron Agar (KIA; BBL™, France), Trypticase Soy Agar (TSA; BBL, USA), Lysine Indole Motility Medium (LIM; Eiken, Japan), VP medium (Eiken, Japan).
Thuéc thir Kowacs, VP1, VP2.
Khang thể chuẩn K88, K99, 987P được cung cấp boi Denka Seiken Co., Ltd.
Tokyo Japan.
Cac héa chat va dung dich ding cho phan tng PCR: TE buffer, TAE buffer,
agrarose, Distilled — Water, Master Mix 2X (Promega Corperation, Madison, USA), Ethidium bromide, 100 bp DNA Ladder (Fermentas, USA).
Các đoạn mỗi sử dụng trong phản ứng PCR để khuếch đại các gene độc tố LT, STa, STb (Promega Corporation, USA).
29
3.3 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu
Nghiên cứu này được khảo sát và tiến hành lấy mẫu tại huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long với số lượng mẫu như sau: trên đàn heo bị tiêu chảy nghi ngờ do vi khuẩn E. coli, lấy từ 1 — 2 mẫu phân heo đặc trưng, đại diện cho đàn và lay mẫu từ nhiều đàn để đại diện cho trại hoặc nông hộ.
Tuy theo quy mô của trại, nông hộ.
Trước khi tiến hành lấy mẫu chúng tôi quan sát tình hình thực tế ở trại, nông hộ: vệ sinh chuồng trại, sát trùng, tình trạng sức khỏe của đàn heo sau đó tiễn
hành thu thập thông tin của nông hộ về số lượng heo, thức ăn, cách xử lí nguồn nước, tiêm phòng... sau đó điền thông tin vào phiều điều tra (xem Phụ Luc 1).
Mẫu được thu thập như sau: dùng bông gòn lau sạch hậu môn heo con bị tiêu
chảy. Dùng kẹp đưa giấy pH vào hậu môn để đo. Dùng tăm bông ngoáy vào trực tràng của heo con bị tiêu chảy. Đưa mẫu tăm bông có phân của heo con tiêu chảy vào ống nghiệm vô trùng có chứa môi trường chuyên chở Carry-
blair. Bảo quản ở điều kiện lạnh và đưa về phòng thí nghiệm để phân lập.
3.3.2 Phương pháp phân lập, định danh vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy trên heo con
Trờn mụi trường MC vi khuẩn E. cứii hỡnh thành khuẩn lạc to, trũn đều, màu hồng nhạt, mặt khuẩn lac hơi lồi, kích thước 2 -3 mm.
Tiến hành: mẫu phân từ que tăm bông được ria cay trên môi trường MC, đem ủ ở 37°C trong 24h. Làm thuần khuẩn lạc bằng cách chọn 8 — 10 khuẩn lạc điển hình, ria cấy trên đĩa thạch MC, đem ú ở 37C trong 24 giờ, sau đó khuẩn lạc được cấy sang môi trường TSA để kiểm tra sinh hóa, giữ giống và định chủng. Qui trình phân lập được thê hiện qua sơ đồ sau:
30
Mau phan
MC
| 37°C/24h
Cấy thuần trên MC
| 37°C/24h
TSA
| 37°C/24h
Thử các chỉ tiêu sinh hóa
E. coli
TSA
37°C/24h
Định chủng
Ỷ Ỷ
K88 K99 987P
—_ ———
ETEC tiéu chay 6 heo con TSA |
Giữ giống a Ly trich DNA
Hình 3.1: Qui trình nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn ETEC
31
Bang 3.1: Cac phan tng sinh hoa dinh danh vi khuan E. coli
Đặc tính KIA
sinh hóa Glucose Lactose H,S Gas Indole M_ VP _ Citrat
R e
E. coli + + - + + + - -
Enterobacter + + - + - - + +
Citrobacter + + - + - + - +
Klebsiella + + - + - - + +
VP:Voges-Proskauer KIA:Kigler Iron Agar MR: Methyl Red (+"): men có sinh hơi
Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi glucose, galactose, mantose, arabinose, xylose, manitol, fructose. Có thể lên men hoặc không lên men đường saccharrose, rafinose, xalixin, esculin, dunxit, glycerol.
Vi khuẩn E. coli được định danh bằng phản ứng sinh hóa qua các môi trường:
KIA: là môi trường Kilgler Iron Agar lấy vi khuẩn từ môi trường TSA cấy vào ống nghiệm chứa thạch nghiêng KIA, ủ ấm ở 37C trong 24 giờ.
Kết quả: E. coli lên men đường lactose, glucose và có sinh hơi.
Phản ứng kiểm tra tính sinh Indole: ding que cấy, cấy một lượng nhỏ vi khuẩn từ môi trường TSA vào ống nghiệm chứa môi trường peptone, ử ấm ở 37C trong 24 giờ. Nhỏ vào môi trường nuôi cấy vài giọt thuốc thử Kowacs. Kết quả là E. coli cho phán ứng dương tính, trên bề mặt xuất hiện một lớp màu đỏ.
Phản ứng Methyl Red (MR) và Voges - Proskauer (VP): dùng que cấy, cấy
một lượng nhỏ sinh khối vi khuân từ môi trường TSA vào ống nghiệm chứa MR - VP ủ ấm ở 37°C trong 24 giờ. Thêm vài giọt thuốc thử Methyl Red, E.
coli cho phản ứng dương tính, môi trường có màu đỏ. Với phản ứng VP, nhỏ vào môi trường nuôi cấy vài giọt thuốc thử VPI, sau đó nhỏ vài giọt VP2 để yên vài phút, E. coli cho phản ứng âm tính, bề mặt môi trường không màu.
Phan tng Citrate: lay vi khuan từ môi trường TSA cấy vào ông nghiệm chứa thạch nghiêng Simmon's citrate, ủ ấm ở 37°C trong 24 giờ. E. coli cho phan ứng âm tính, môi trường không đồi màu.
3.3.3 Phương pháp định danh các chúng vi khuẩn E. eoli bằng phản ứng huyệt thanh học
Sau khi đã kiểm tra sinh hóa xác định được vi khuẩn E. coli, tién hanh định chủng bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với các kháng thể
chuẩn K88, K99, 987P (Moon và ctv., 1977).
32
Tiến hành: xác định chủng K88: trên phiến kính sạch cho một giọt nước muối sinh lí và một giọt kháng thể chuẩn ching E. coli K88, trộn mỗi giọt trên với mỗi vòng que cấy đầy vi khuẩn của mẫu kiểm tra. Lắc trộn nhẹ nhàng và đọc kết quả sau 30 giây đến 15 phút. Mẫu dương tính chỉ ngưng kết ở giọt kháng thể mà không ngưng kết với giọt nước muối sinh li.
Xác định chung E. coli K99, 987P: quy trình tương tự như xác định chủng K88.
Phán ứng định danh được thể hiện qua sơ đồ sau:
Vi khuẩn E. coli
Kháng thể chuẩn Đôi chứng âm
K88, K99, 987P
Phản ứng âm tính
Phản ứng dương tính (không có ngưng kêt)
(có ngưng kết)
|
E. coli K88, K99, 987P
Hinh 3.2: Dinh danh ching vi khuan E. coli bang
phan ứng ngưng kết nhanh trên phiên kính
3.3.4 Xác định độc tố của vi khuẩn ETEC gây tiêu chảy trên heo con bằng phương pháp PCR
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp Invitro
để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại
33
nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ vào hoạt động của enzyme polymerase và các cặp mỗi (primer) đặc hiệu cho DNA này.
Hiện nay kĩ thuật này được sử dụng rộng rãi đề phát hiện, tạo các gene, chuẩn đoán bệnh, phát hiện các mam bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm. a
Trong chuẩn đoán xác định độc tố ruột vi khuẩn ETEC hiện nay thì phương pháp PCR được đánh giá là phương pháp có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh
và phù hợp. PCR gồm nhiều chu kì nối tiếp nhau. Mỗi chu kì gồm 3 bước (Trần Linh Thước, 2010):
Bước I (biến tính — denaturation): trong mot dung dich phan img gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tứ DNA thường được biến tính ở nhiệt độ cao, thường là 94 — 95°C. Mạch đôi DNA tách ra thành dạng mạch đơn.
Bước 2 (bắt cặp — anealafion): trong bước này nhiệt độ được hạ thấp cho phép các moi bat cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao
động từ 40 — 70C.
Bước 3 (tổng hợp — elongafion): nhiệt độ được tăng lên đến 72°C giúp cho enzyme polymerase (vốn là polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất, thời gian của bước này phụ thuộc vào trình tự DNA cần khuếch đại,
thường kéo đài từ 30 giây đến vài phút.
Xác định các độc tố đường ruột của vi khuẩn E. coli bang phan img PCR như mô tả cua Lee et al., (2008).
Chiết tách DNA mẫu (DNA template)
Mẫu DNA của vi khuẩn E. coli được chiết tach bằng phương pháp sốc nhiệt.
Chuẩn bị: khuân lạc của vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường NA sau 24
giờ, nước cất tinh khiết không chứa DNA, RNA.
Cách thực hiện:
Ding pipette hút Iml nước cất tinh khiết cho vào ống eppendorf.
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên môi trường NA (lấy đầy que cấy) cho vào ống eppendorf trên.
Trộn đều bằng máy vortex.
Đun sôi ở 100°C trong 10 phút.
Ly tâm 15.000 vòng/15 phút.
Thu hoạch phần dịch nổi bên trên có chứa DNA của tế bào vi khuẩn, bảo quản
ở -20C.
34
Đoạn mỗi dùng trong phán ứng PCR
Trình tự nucleotide các cặp mỗi dùng để xác định độc tố của vi khuẩn E. coli dua theo Kim et al., (2010).
Bảng 3.2: Trình tự nucleotide và kích thước các cặp mồi dùng cho phan tng PCR xác định các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coi (Kim ef al, 2010)
Gene mục Trình tự nucleotide Kích thướt sản
tiêu 6-3”) pham (bp)
LT ATTTACGGCGTTACTATCCTC 281
TTTTGGTCTCGGTCAGATATG
STa GCTAATGTTGGCAATTTTTATTTCTGTA 190
AGGATTACAACAAAGTTCACAGCAGTAA
STb GCCTATGCATCTACACAATA 279
TGAGAAATCGACAATGTCCG
Hỗn hợp nhiên liệu trong phán ứng
Phan img PCR phat hién gene qui định một số yếu tố độc lực của vi khuân E.
coli được thực hiện với tổng thể thể tích 25 ul với các hóa chất do Promega (USA) san xuat va cung cap.
Bang 3.3: Hỗn hợp master mix của phản ứng PCR xác định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli gay tiêu chảy trên heo con (Promega Corporation, USA)
STT Thanh phan Số lượng
1 Nước tinh khiết không chứa DNA, RNA 9,5 ul
2 Master Mix 2X 12,5 ul
3 Mỗi xuôi 0,5 ul
4 Môi ngược 0,5 ul
5 DNA mau 2ul
Tống 25 pl
Chu trình nhiệt của phan tng PCR
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR theo chu trình nhiệt ở bảng sau:
35
Bang 3.4: Chu trinh nhiét cia phán ứng PCR xác định các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli (Kim et al., 2010)
Gene Chu trinh nhiét
mục Tiềnbiến — Biến tính Gắn mồi Kéo dai Kết thúc
teu . tớnh ứ C/phỳ) C/phỳt) 0 (đC/phỳt) P (°C/phỳt 4
( C/phúU) Lặp lại chu kì 30 lần
LT 94/10 94/1 52/10 72/1:30 72/10
STa 94/10 94/1 55/10 72/1:30 72/10
STb 94/10 94/1 51/10 72/1:30 72/10
Phương pháp điện di sản phẩm PCR
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm được điện di trên thạch agarose 1,5%, dung môi dién di la TAE 1X buffer. Hut 10 HI DNA ladder cho vào giếng thứ nhất của gel agarose, giéng thứ 2 và giếng thứ 3 lần lượt cho 10 pl đối chứng đương và đối chứng âm, kê từ giếng thứ 4 trở đi cho vào 10 pl san
phẩm PCR. Sau đó đặt gel vào buồng điện di và chạy ở hiệu điện thế 50V
trong thời gian | gio.
Nhu6ém ban gel agarose trong Ethidium bromide
Sau khi kết thúc quá trình điện di, cho gel agarose vao dung dich Ethidium bromide, trong thời gian 30 phút.
Đọc kết quá và chụp ánh
Sau khi nhuộm bản gel trong Ethidium bromide xong, gel được đưa vào buồng đọc kết quả dưới đèn tia UV và chụp ảnh.
Kích thước các đoạn gel sau khi khuếch đại được xác định dựa vào thang
DNA chuan 100bp.
3.3.5 Các chí tiêu theo dõi
Khảo sát điều kiện tự nhiên và tình hình chăn nuôi của huyện Vũng Liêm, Long Hỗ và thành phố Vĩnh Long.
Tỷ lệ tiêu chảy trên heo con tại huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long.
Tỷ lệ tiêu chảy trên heo con theo mẹ và sau cai sữa.
36
Tý lệ nhiễm vi khuân E. col trên heo con theo địa điểm.
Tỷ lệ nhiễm vi khuân E. coi trên phân heo con theo lứa tuổi.
Tỷ lệ định danh các chủng vi khuan E. coli K88, K99, 987P trén heo con theo
dia diém
Tý lệ định đanh các chủng vi khuẩn E. coli K88, K99, 987P trên heo con theo
mẹ va sau cai sữa.
Kết quả xác định độc tố của vi khuẩn ETEC gây tiêu chảy trên heo con.
3.4 Phương pháp xử lí số liệu
Số liệu được xử lí thống kê theo Phương pháp Chi — square bang phan mềm Minitab 16.0, Chi square Yates và Fixer Exactly Test bằng phần mềm Excel 2010.
37
CHUONG 4