Dùng dao lấy khoảng 10 - 15 g đất theo các độ sâu: 0 cm, 5 cm, 10 cm, 15 cm, 20 cm, 25 cm, 30 cm ở 5 vị trí A, B, c, D, E (hình 2.1). Các mẫu đất được đựng vào túi nilon đã khử trùng, buộc kín miệng túi. Mỗi túi đựng một mẫu đất ở một độ sâu nhất định. Trên mỗi túi ghi rõ nơi lấy mẫu, loại đất, thời gian và độ sâu lấy mẫu. Sau đó, các mẫu đất được chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập ngay hoặc có thể bảo quản trong tủ lạnh ở 4°c tối đa 6 ngày [9].
2.3.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn theo Vỉnogradskỉ
Cân 1 g đất cho và bình nón 50 ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 30 phút.
Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml dịch đất sang ống nghiệm có chứa 4,5 ml nước vô trùng Hình 2.1. Bản đồ khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc
nhỏ 0,1 ml sang đĩa petri chứa môi trường Gause
I. Dùng que gạt vô trùng chang đều, sau đó nuôi trong tủ ấm từ 7 - 12 ngày. Trên mỗi mẫu đất khuấn lạc của xạ khuẩn được cấy sang đĩa petri chứa môi trường Gause I để làm sạch. Các khuẩn lạc được cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng Gause I, tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 7
- 12 ngày [10]. Với mỗi mẫu đất ở các độ sâu khác nhau cấy lên 3 môi trường: Gause I, Czapeck- tinh bột, Czapeck - glucose.
2.3.3. Phương pháp bảo quản chủng giống
Sau từ 7 - 12 ngày nuôi cấy mẫu trong tủ ấm 28 - 30°c, chuyển sang để ở tủ lạnh nhiệt độ 2 - 4°c. cấy chuyển định kì 2 tháng 1 lần trên môi trường Gause I. Trước khi sử dụng giống cần hoạt hóa xạ khuẩn [10].
2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn Quan sát hình thái của hệ sợi khí sinh
Dựa theo tài liệu của ISP, Gause và cộng sự (1983), xác định màu sắc của HSKS dựa vào bảng màu của Tresner và Buckus [28]. Căn cứ vào màu sắc HSKS của các chủng mới phân lập để phân thành 8 nhóm màu: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, và nhóm màu không xác định (X).
Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất
Màu sắc của HSCC được xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Bondarsev (1953), Tresner và cộng sự (1961).
Quan sát cuống sinh bào tử
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause I có găm lamen nghiêng 45°c trên bề mặt môi trường. Sau 7-9 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tủ’ có dạng thắng hay lượn sóng ký hiệu là RF (Rectus Flexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Rectinaculum Apertum) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là s (Spira). [26], [27], [28].
Các chủng xạ khuấn được nuôi cấy trên môi trường Gause I hoặc Czapek - tinh bột trong các đĩa petri, sau 7 - 1 2 ngày nuôi cấy ở 28- 30°c, dùng lưới đồng Collodion đặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn lạc. Quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử JEM - T8 của Nhật tại Viện vệ sinh dịch tễ Hà Nội.
2.3.5. Nghiên cứu đặc điếm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn Khả năng sử dụng nguồn c
Cấy xạ khuẩn trên môi trường ISP - 9 không có nguồn c, sau đó bố sung 1% các iĩguôn đường: glucose, lactose, mântõse, fructose.
Tiến hành cân 1 g đường, khử trùng bằng đèn tử ngoại 30 phút, sau đó bố sung đường vào 10 ml môi trường ISP - 9 còn nóng, lắc đều. Rót môi trường vào hộp petri, để khô. cấy xạ khuẩn vào, nuôi ở 28 - 30°c trong 14 ngày, quan sát đánh giá sự sinh trưởng của các chủng và so sánh với đối chứng. Môi trường có glucose là đối chứng dương, không bổ sung đường là đối chứng âm [7].
Khả năng sử dụng nguồn N
Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường Gause I, không có KNO3 thay thế bằng các hợp chất nitơ tương ứng.
Tiến hành: cân nguồn N hữu cơ (cao nấm men, bột đậu tương...), nguồn N vô cơ bổ sung vào môi trường. Sau đó, thanh trùng môi trường ở latm trong 30 phút. Đưa môi trường vào các đĩa petri, đợi khô, cấy xạ khuẩn vào nuôi ở 28 - 30°c. Sau 10 - 12 ngày quan sát sự sinh trưởng của xạ khuẩn [7].
Khả năng sinh enzyme ngoại bào
Khả năng phân giải cellulose trên giấy lọc vô trùng trong môi trường cellulose hoặc CMC. Hoạt tính được xác định bằng dung dịch Lugol sau 4 ngày nuôi cấy [7].
2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính celỉulase của xạ khuẩn Chiết dịch enzyme
Thu enzyme từ môi trường nuôi cấy đặc: cân 5 g mẫu sinh khối nghiên cứu, nghiền nhỏ, cho vào bình nón có sẵn 70 ml nước. Đe vào tủ ấm 30°c trong 30 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Định mức đến vạch, lắc đều, lọc. Dịch trong thu được là enzyme thô để dùng cho các thí nghiệm [10].Thu enzyme từ môi trường lỏng: lọc bỏ sinh khối
enzyme thô.
Phương pháp khuếch tán trên thạch
Chuẩn bị môi trường cơ chất + thạch (pH = 7,0 - 7,2) gồm 20 g thạch agar + 2 g CMC (hoặc 2 g bột cellulose) trong 1000 ml nước. Thanh trùng ở latm trong 30 phút.
Đố môi trường vào các hộp petri sao cho bề dày lớp thạch khoảng 3mm. Dùng khoan nút chai đục lỗ (d = 10 mm) trên lóp thạch cách nhau 40 mm. Nhỏ 0,2 ml dịch enzyme cần thử và 0,2 ml H20 làm đối chứng, để trong tủ lạnh 4°c khoảng 4 giờ, sau đó đặt vào tủ ấm 30°c trong 24 giờ.
Hoạt tính enzyme được xác định bằng giá trị D - d (mm) sau khi nhuộm màu bằng thuốc thử lugol. Vùng CMC (hay glucose) bị phân giải không bắt màu ở xung quanh lỗ thạch [10].
s
yfn
enzyme
Cấy xạ khuẩn vào môi trường Gause I trong ống nghiệm (5ml/ống), đặt trên máy lắc 160 vòng/phút khoảng 24 giờ. Sau đó dùng pipet đưa 0,5 ml dịch nuôi cấy vào lần lượt 6 ống nghiệm đựng sẵn 5 ml môi trường Gause I. Cứ sau 24 giờ thu được enzyme và xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp khuếch tán trên thạch. Ket quả đánh giá dựa vào kích thước vòng phân giải (D - d, mm) [7].
Phương pháp xác định pH thích hợp
Xạ khuẩn được cấy vào môi trường ISP - 1 đã chỉnh pH từ 3 - 10. Nuôi ở nhiệt độ 28°c và 37°c. Sau 7 - 1 0 ngày lấy ra quan sát sự sinh trưởng
[12].
2.3.7. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Kết quả nghiên cún được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học dựa trên phần mềm Excel. Đây là phần mềm lập trình sẵn, các hàm sử dụng được dựa trên những công thức cơ bản của toán thống kê trong đó có công
■ Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại
■ Trung bình bình phương các sai lệch: ồ =
■ Sai số m : ±m =
Trong đó: Xj : giả trị của mỗi lần do n : so lần đo