2.2. Giới thiệu về Listeria monocytogenes
2.2.5. Yếu tố độc lực
PrfA
Hình 2.10: Vị trí tổ hợp gen qui định độc tính trong L. monocytogenes.
Phần lớn tổ hợp gen này tham gia trong việc xâm nhập vào tế bào chủ và tiến hành chu kỳ xâm nhiễm bên trong các tế bào của tác nhân gây bệnh. Tổ hợp này mã hóa bao gồm 6 gen plcB, hly, mpl, actA, plcB, prfA và có 3 khung đọc mở X, Y, Z.
Trong đó gen prfA rất cần thiết cho tính độc của loài L. monocytogenes, có vai trò như yếu tố điều hòa chính nhằm ổn định hoạt động của tổ hợp gen này. Bên cạnh đó, gen hly mã hóa protein tạo sản phẩm listeriolysin O (LLO), plcA mã hóa tạo phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC), plcB mã hóa tạo phosphatidulcholine-spefic phospholipase C (PC-PLC).
Tương tự như LLO, các phospholipase C này dung giải tế bào chủ bằng cách tạo một lổ nhỏ trên tế bào và phá vở lipid màng tế bào. Vi khuẩn sinh ra một protease mpl phụ thuộc Zn+ có hoạt tính như một vài ngoại độc tố.
Z Y X plcB actA mpl hly plcA prfA
SVTH: Võ Thành Hưng 30 Ngoài ra có một vài gen c qui định tính gây độc nhưng tổ hợp gen nói trên bao gồm inlA, inlB, inlC mã hóa lần lượt cho internalin A, B và C. Các gen này đóng vai trò quan trọng nhằm nội bộ hóa tế bào chủ do tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên tất cả các gen trong tổ hợp gen gây độc và tất cả các gen nằm ngoài tổ hợp gen này vẫn hoàn toàn phụ thuộc vào hoạt động của yếu tố prfA.
Bảng 2.6: Chức năng của các gen trong hoạt động tạo độc tố của L. monocytogenes.
Gen Chức năng
prfA Positive regulotory factor A Hoạt hóa cho quá trình lây lan tronh tế bào chủ của vi khuẩn.
plcA Phosphatidylinositol-specific
phopholipase C Dung giải màng không bào của thể thực bào.
plcB Phosphatidylcholine-specific
phospholipase C Dung giải màng không bào của thể thực bào.
hlyA Listeriolysin O Giải phóng vi khuẩn ra khỏi không bào.
Mpl Zinc-dependent metalloprotease Tham gia trong quá trình hoạt động của plcB.
actA Actin-polymerizing protein Giúp lây nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác.
inlA Internalin A Nội bộ hóa tế bào chủ.
inlB Internalin B Nội bộ hóa tế bào chủ.
2.2.5.1. Listeriolysin O
LLO là một yếu tố độc lực chính được sinh ra bởi L. monocytogenes giúp cho L.
monocytogenes thoát khỏi các không bào thực bào đầu tiên. Nó là một protein có trọng lượng phân tử 58,5 kDa được tạo thành bởi một chuỗi đơn polypeptide gồm 529 aa.
Trình tự đầu N có đặc điểm của trình tự dấu hiệu điển hình ở vi khuẩn Gram dương:
phần đầu có tính ái nước và mang điện tích dương được theo sau bởi 20 đầu kỵ nước.
Trình tự này mã hóa trực tiếp cho protein và được phân cắt sau vị trí lysine 25. Kết quả
SVTH: Võ Thành Hưng 31 là LLO được bắt đầu từ amino acid 26, là một phân tử protein dài 504 aa và có trọng lượng phân tử 55,8 kDa.
LLO thuộc về họ độc tố gắn cholesterol được hoạt bởi nhóm thiol được tạo ra bởi hầu hết các vi khuẩn Gram dương. Một số độc tố thuộc họ này như Streptolysin O từ Streptococcus pyogenes, pneumolysin O từ Streptococcus pneumoniae, perfringolysin O từ Clostridium perfringens, cereolysin O từ Bacillus cereus, alveolysin O từ Bacillus alvei … Hoạt tính ly giải của các độc tố này được tăng cường bởi các tác nhân ức chế và bị kìm hãm bởi sự oxy hóa và biểu hiện khi có cholesterol hoặc kháng thể kháng streptolysin O. Cytolysin được hoạt hóa bởi thiol có một cystein đơn ở vùng đầu C làm cho chúng dễ bị bất hoạt bởi sự oxy hóa mặc dù cystein này có thể được thay thế bằng alanine mà không làm mất chức năng ly giải. Chúng tạo nên những lỗ không liên tục với đường kính bên trong lên đến 30 nm trên những màng chứa cholesterol. Cơ chế hoạt động của chúng dựa vào sự tương tác với cholesterol với chức năng không chỉ là vị trí gắn kết mà còn như một tác nhân làm thay đổi hoạt động của enzyme dẫn đến quá trình oligomer hóa của khoảng 20 – 80 toxin monomer thành cấu trúc vòng hoặc giống vòng cung.
LLO cho thấy sự tương tác kỳ lạ với cholesterol trong dung dịch như sau: protein bị bất hoạt bởi cholesterol nhưng, thay vì giống các độc tố khác, duy trì khả năng gắn trên màng. 1 HU (hemolytic unit) LLO có thể bất hoạt 0,2 ng cholesterol trong khi các sterol khác như epicholesterol và dehydroepiandrosterone là những chất ức chế yếu.
Chất oxy hóa HgCl2 và p – chloromercuribenzoate bất hoạt độc tố ở nồng độ 1 mM. Sự ức chế bởi các hợp chất thủy ngân bị đảo ngược bởi dithiothreitol 2 mM hoặc cystein, iodacetic acid 2 mM, iodacetamide 2 mM, 1 mM tosyllysine chloromethyl ketone và 1 mM tosylphenylalanine chloromethyl ketone không ức chế.
Hoạt tính dung huyết của LLO có liên quan đến pH của môi trường: nó hoạt động cao nhất ở pH 5,5 và gần như bị bất hoạt ở pH 7,0. Trái lại, các độc tố được hoạt hóa bằng thiol có phổ pH hoạt động rộng hơn như pH 6.0 đối với pneumolysin, pH 6.5 đối với perfringolysin O và alveolysin, pH 7.0 đối với streptolysin O. Sự phát hiện này có thể giải thích vai trò của LLO trong quá trình xâm nhiễm của L. monocytogenes. Sau
SVTH: Võ Thành Hưng 32 quá trình thực bào, môi trường acid của không bào chứa tế bào vi khuẩn sẽ hoạt hóa LLO. Chính độc tố này sẽ xúc tiến quá trình ly giải không bào và tế bào vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chất trong khi đó, môi trường pH cao hơn sẽ làm giảm hoạt tính của LLO. Sự hư hại của màng tế bào chủ cũng bị ngăn cản bởi sự phân hủy nhanh của LLO trong tế bào chất do sự nhận biết của một trình tự giống PEST. Một trình tự amino acid giàu Proline (P), glutamic acid (E), serine (S) và threonine (T) được gọi là PEST và protein đích để phân hủy. Và đầu N của LLO nằm ở vùng 19 aa (từ 32 – 50) chứng minh đặc điểm này. Một điều thú vị khi loại bỏ motif giống PEST này không chỉ nâng cao độc lực của LLO mà còn sửa đổi các yếu tố độc lực của vi khuẩn. L. monocytogenes bị đột biến, thiếu trình tự PEST LLO, được chứng minh là việc thoát ra khỏi không bào thực bào theo một con đường rất khó khăn. Điều này chứng tỏ rằng vùng này cũng rất quan trọng cho quá trình phá hủy màng.