2.3.2. Các phương pháp hiện đại
2.3.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Tất cả các mục tiêu khuếch đại được phát hiện bằng một số đặc điểm cơ bản. Sử dụng quy trình công nghệ enzyme trong đó một enzyme đơn hoặc enzyme tổng hợp nhiều bản sao của các mục tiêu axit nucleic. Tuy nhiên, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là phản ứng đầu tiên và vẫn là kỹ thuật được áp dụng rộng rãi nhất. PCR là một phương pháp đơn giản để nhanh chóng khuếch đại chuỗi DNA mục tiêu. một DNA polymerase nhiệt có khả năng tổng hợp DNA cụ thể, và sợi kép DNA chức năng như một mẫu khuôn để để thực hiện phản ứng DNA polymerase. Quá trình PCR bắt đầu ở nhiệt độ cao ( 940C) để biến tính và tháo xoắn DNA sợi kép thành DNA sợi đơn, tiếp
SVTH: Võ Thành Hưng 50 theo là nhiệt độ tương đối thấp (540C) để kích hoạt quá trình bắt cặp của các nucleotide và mạch khuôn, và sau đó là ở 720C để cho phép sao chép DNA polymerase của mẫu.
Toàn bộ quá trình được lặp đi lặp lại 25 - 30 chu kỳ để một bản sao của mẫu DNA có thể biến thành hàng tỷ bản sao trong vòng 3 - 4 giờ.
Gel điện di thường được sử dụng để phát hiện các sản phẩm khuếch đại. Khi hết mồi xunh quanh DNA khuôn, khối lượng và kích thước của gel đích có thể được dự đoán và phát hiện với một vết DNA (Wang et al., 1993; Manzano et al., 2000; Volokhov et al, 2002.). Bằng cách xác định sự khác biệt trong phân tử gen 16S và 23S rRNA, vùng gel đệm, hly, inlA, inlB, IAP và gen khác của L. monocytogenes được nhanh chóng và phân biệt chính xác giữ Listeria khác loài và vi khuẩn thông thường. PCR khảo nghiệm đa thành phần đã được sử dụng để khuyếch đại một cách chọn lọc gene IAP và tạo thuận lợi cho việc xác định sự khác biệt của tất cả sáu loài Listeria trong một thử nghiệm đơn (Bubert et al., 1999). Tuy nhiên, nên cần thận trọng để xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại, có thể thấy sự khác biệt kích thước giữa các loài Listeria. Như vậy, xác định gen mục tiêu cho một loài Listeria duy nhất có thể được tốt hơn, vì nó cung cấp một biểu hiện độc lập xác nhận của loài (Gilot và nội dung, năm 2002; Liu et al., 2003b, 2004a, 2004b, 2004c, 2005b). Nếu đồng hiện diện của một số loài vi khuẩn Listeria làm phức tạp việc xác định các L. monocytogenes, thì khảo nghiệm đa thành phần là rất hữu ích để nhận dạng và đặc tính của vi khuẩn phân lập.
Việc sử dụng các đoạn mồi PCR nhóm cụ thể, đã cung cấp công cụ bổ sung để xác định L. monocytogenes (Jinneman và Hill, 2001; Borucki và Call, 2003; Doumith et al. , 2004a).
Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là những trình tự DNA của gen định đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc các gen quy định việc tổng hợp một loài độc tố chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới. Khi cung cấp hai nguồn mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của trình tự DNA, với điều kiện DNA polymerase hoạt động trong phản ứng PCR,
SVTH: Võ Thành Hưng 51 một đoạn DNA nằm giữa hai đầu mồi sẽ được tạo nên. Như vậy để khuếch đại trình tự DNA xác định, ta có những thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo cac mồi bổ sung chuyên nghiệp. Các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer) so với chiều phiên mã của gen.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
biến tính (denaturation), lai (anealation), tổng hợp (elongation). Phân tích sản phẩm khuếch đại bằng sự điện di trên gel agarose. Đặc trưng của phản ứng khuếch đại đối với từng vi sinh vật mục tiêu thông qua kích thước của sản phẩm khuếch đại.
SVTH: Võ Thành Hưng 52 Sơ đồ phản ứng PCR:
SVTH: Võ Thành Hưng 53
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) với cặp mồi LM-F LM-R:
Chủng vi sinh vật: L. monocytogenes
Chuẩn bị thí nghiệm:
Trình tự gen hlyA của các chủng L. monocytogenes đã được công bố trên ngân hàng gen.
Phần mềm BLAST dung để xác định trình tự gen đích hlyA của các L.
monocytogenes. (Kanamyxin, Xgal, Eco RI, bộ kit tách dòng Topo TA Cloning Kit, bộ kit tách và tinh sạch plasmid QIA prep Spin Miniprep Test Kit),kit xác định trình tự BigDye Terminator v3.1
Cặp mồi LM-F và LM-R được thiết kế bao gồm 20 bp/mồi cho sản phẩm PCR 468 bp.
Hoá chất sử dụng cho tách chiết DNA tổng số, hoá chất cho điện di trên gel agarose, thang DNA chuẩn 100 bp và 1000bp .Các hoá chất khác ở độ tinh khiết phân tích.
Phương pháp tiến hành thí nghiệm : Mồi cho phản ứng PCR
Dựa trên các trình tự gen hlyA của các chủng L. monocytogenes đã được công bố trên ngân hàng gen, cặp mồi LM-F và LM-R được thiết kế bao gồm 20 bp/mồi cho sản phẩm PCR 468 bp .
Xác định tính đặc hiệu của mồi
Khả năng bắt cặp chính xác của mồi được khẳng định bằng cách phân tích trình tự sản phẩm PCR theo phương pháp của Sanger và cộng sự và so sánh với trình tự các gen đích hlyA của các L. monocytogenes theo phần mềm BLAST. Tính đặc hiệu của mồi được khảo sát bằng cách kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi thiết kế với các khuôn DNA của vi khuẩn L. monocytogenes và không phải L. monocytogenes trong phản ứng PCR.
Phản ứng PCR
DNA khuôn từ L. monocytogenes được thu nhận cho phản ứng PCR bằng cách tách và làm sạch DNA với chloroform hoặc xử lý nhiệt tế bào ở 100 0C trong 10 phút.
Tối ưu hoá điều kiện PCR về nồng độ Mg2+ (1,5 - 4,0 mM), nồng độ mồi (0,1 - 0,5 pmol/mồi) và nồng độ dNTPs (100 - 250 mM/mỗi loại). Phản ứng PCR được thực hiện
SVTH: Võ Thành Hưng 54 với thể tích hỗn hợp 25 ml với chu trình nhiệt gồm 94 0C - 3 phút, (94 0C 1 phút, 60 0 C 1phút, 72 0C 1 phút) x 30 trình, 72 0C- 5 phút và 4 0C - 5 phút. Đánh giá kết quả phản ứng PCR dựa trên phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 1% với 3 ml sản phẩm.
Xác định độ nhạy của phương pháp
Môi trường nuôi qua đêm của L. monocytogenes trên môi trường LEB được định lượng, pha loãng tới các mật độ thích hợp. Ly tâm thu sinh khối của 1 ml canh trường hòa tan trong 100 ml TE, xử lý nhiệt thu DNA cho phản ứng PCR. 3ml dịch tế bào đã qua xử lý nhiệt được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Đánh giá kết quả phản ứng PCR nhờ phân tích sản phẩm bằng điện di trên agarose 1%.
DNA bộ gen
DNA bộ gen từ L. monocytogenes được tách và làm sạch dùng làm khuôn cho phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen mục tiêu hlyA với cặp mồi LM-F và LM-R, Kết quả phản ứng PCR với khuôn DNA tinh sạch cho thấy một băng DNA có kích thước nằm trong khoảng kích thước sản phẩm PCR thiết kế.Với mục đích thu nhận DNA bản mẫu cho phản ứng PCR một cách đơn giản hơn, huyền phù L.monocytogenes được xử lý nhiệt ở 100 0C trong 10 phút để phá vỡ tế bào, giải phóng DNA, ly tâm 10000 vòng/phút x 10 phút, thu dịch ly tâm chứa DNA làm khuôn cho phản ứng PCR.
Kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi LM-F, LM-R.
Để khẳng định khả năng bắt cặp chính xác của cặp mồi LM-F, LM-R với gen hlyA của L. monocytogenes, trình tự sản phẩm PCR của cặp mồi này được xác định và so sánh với kết quả xử lý plasmid trình tự gen đích hlyA của các L. monocytogenes. Sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại bằng cặp mồi LM-F,LM-R được gắn trực tiếp vào vectơ pCR4 – TOPO. DNA plasmid chứa sản phẩm PCR được tách dòng trong E.coli DH5a. Tiến hành tách chiết và tinh sạch plasmid tái tổ hợp (sử dụng bộ kit QIA prep Spin Miniprep Test Kit), kiểm tra sản phẩm trên agarose 1%. Kết quả điện di cho thấy các plasmid của khuẩn lạc trắng có kích thước lớn hơn so với đối chứng .
Sản phẩm PCR gắn trong plasmid được kiểm tra bằng cách cắt với EcoRI. Tái tổ hợp với EcoRI cho thấy đoạn DNA chèn vào plasmid có kích thước tương ứng với kích thước sản phẩm PCR. Trình tự sản phẩm PCR được xác định bằng thiết bị xác định trình
SVTH: Võ Thành Hưng 55 tự tự động ABI 3100 Avant. Trình tự này được so sánh với trình tự hlyA của cácL.
monocytogenes đã được công bố. Kết quả so sánh cho thấy sản phẩm PCR khuyếch đại bằng cặp mồi LM-F, LM-R có kích thước 468 bp, đạt độ tương đồng trình tự >98 % với trình tự hl yA của 53 chủng L. Monocytogenes công bố. Như vậy, cặp mồi LM-F, LM-R đã thiết kế cho phép nhận chính xác đoạn gen hlyA của L. monocytogenes.
Xác định điều kiện tối ưu cho PCR.
Nồng độ Mg 2+ :
Phản ứng PCR được thực hiện ở các nồng độ cuối cùng của Mg 2+ từ 1,5 mM đến 4,0mM.
Nồng độ dNTPs:
Phản ứng PCR được thực hiện với nồng độ dNTPs từ 100 mM đến 250 mM.
Nồng độ mồi
PCR được thực hiện tại các nồng độ mồi khác nhau từ 0,1 đến 0,5 pmol.
Dịch tế bào được xác định mật độ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Pha loãng dịch vi khuẩn tới các nồng độ khác nhau , xử lý nhiệt các dịch huyền phù vi khuẩn. 3ml dịch sinh khối vi khuẩn sau khi xử lý nhiệt dùng làm khuôn cho phản ứng PCR cho thấy phản ứng PCR cho kết quả dương tính với các mẫu có mật độ tế bào 6x102 /phản ứng tương ứng với mật độ tế bào từ 2.104 CFU/ml.
Như vậy, phương pháp PCR phát hiện L. Monocytogenes có độ nhạy tương đương với kít thương mại BAXTM của Qualicon. Inc., (104 CFU/ ml) nhưng nhỏ hơn của Listeria monocytogenes LightCycler của Roche (103 CFU/ ml). Cặp mồi LM-F, LM-R thiết kế đặc hiệu với L. monocytogenes, cho phép phát hiện vi khuẩn gây bệnh L.
monocytogenes ở mật độ 6.102 CFU/phản ứng (2. 104 CFU/ml).
Bộ kit PCR:Với độ nhạy rất cao với các vi khuẩn, cứ trong 25g mẫu thực phẩm có một con vi khuẩn cần tìm thì PCR sẽ phát hiện ra chúng. Điều đặc biệt là các bộ kít không chỉ gọi tên một loại vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm mà chúng có thể phát hiện ra 12 loại vi khuẩn khác nhau như: e.coli, e. coli 0157:h7, salmonella spp, shigella spp, nấm mốc... Tùy thuộc vào loại thực phẩm và số loại chỉ tiêu vi khuẩn gây bệnh cần kiểm soát đối với mỗi loại thực phẩm, các quy trình và bộ Kit PCR cho phép
SVTH: Võ Thành Hưng 56 xét nghiệm và gọi tên tất cả các vi khuẩn nêu trên trong vòng 24 giờ (trừ Clostridium botulinum, cần thời gian nuôi cấy tăng sinh dài). Chúng được thiết kế cho 50 phản ứng PCR với 50 ống phản ứng, chứa đầy đủ thành phần dung dịch đệm PCR, mồi, nước... để giúp kiểm tra chính xác mức độ nhiễm vi sinh vật trầm trọng hay không. So với phương pháp nuôi cấy truyền thống, phương pháp này cho hiệu quả chính xác và hay hơn ở chỗ, nó phát hiện nhiều vi khuẩn gây bệnh hơn và tốn rất ít thời gian.
Ưu điểm của phương pháp PCR:
Thời gian cho kết quả nhanh.
Có thể nhận diện những vi sinh vật khó nuôi cấy. việc nuôi cấy tăng sinh là đơn giản hơn và có khi không cần thiết.
Hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học. Không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện ở hiện trường.
Ít tốn kém về mặt nhân sự. Có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.
Mặc dù vậy phương pháp vẫn còn một số khuyết điểm cần khắc phục:
Sự ức chế hoạt tính của Tag DNA polymerase bởi thành phần của mẫu vật. mẫu thực phẩm thường có những thành phân phức tạp. việc chiết tách và tinh chế DNA từ thực phẩm hai môi trường trước khi thực hiện phương pháp PCR cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế. Tuy nhên một vài quy trình phát hiện vi sinh vật gây bệnh thực phẩm bằng PCR không cần tách chiết, tinh chế DNA.
Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp, nê trong đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có được mật độ đủ để phát hiện bằng PCR.
Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống hay tế bào chết. do vậy có thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết. Ngược lại phương pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh, hay tế bào đã chết của vi sinh vật gây bệnh hoặc ngộ độc.