4. Nội dung nghiên cứu
2.2. Phương pháp nghiên cứu
a. Thí nghiệm 1: Thí nghiệm tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
- Mục tiêu thí nghiệm: Tìm ra môi trường dinh dưỡng tối ưu bằng cách tối ưu hóa được các yếu tố đa lượng trong môi trường BBM (N, P) dùng để
nuôi vi tảo H. lacustris.
- Mô tả thí nghiệm: Thí nghiệm tối ưu hoá được thiết kế thử nghiệm dựa trên cấu trúc của mô hình bố trí thí nghiệm trung tâm (CCD-Central composite design) đối với 2 yếu tố dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy BBM: Hàm lượng Nitơ và Photpho được gọi là các biến độc lập. Các điểm trung tâm và bước nhảy của mỗi yếu tố được xác định lần lượt là N = 0,8 ± 0,4 và P = 0,04 ± 0,02 dựa trên các thí nghiệm sàng lọc và nghiên cứu tài liệu.
Biến đáp ứng được chọn là tốc độ sinh trưởng.
Mô hình dự đoán được biểu diễn bằng phương trình bậc 2 đầy đủ:
Y = β + β1x1 + β2x2 + β12x1x2 + β11x21 + β22x22
Trong đó, Y là tốc độ tăng trưởng (d); x1, x2 lần lượt là Nitơ và Photpho;
β1, β2 là các hệ số bậc 1 tương ứng; β12 là hệ số tương tác của cặp yếu tố tương ứng; β11, β22 là các hệ số bậc 2 tương ứng.
- Thông số theo dõi: Mật độ tế bào vi tảo H. lacustris.
b. Thí nghiệm 2: Thí nghiệm ảnh hưởng của sự thiếu hụt dinh dưỡng tới khả năng tổng hợp astaxanthin ở vi tảo H. lacustris trong mô hình nuôi hai pha.
Mục tiêu thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của sự thiếu hụt dinh dưỡng tới khả năng kích ứng tổng hợp astaxanthin ở vi tảo H. lacustris trong mô hình nuôi hai pha.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. NT1:
môi trường không có Nitrat (0N), NT2: môi trường không có Nitrat Phosphat (0N0P), NT3: môi trường không chứa Phosphat (0P), NT4: môi trường BBM, NT5: mụi trường chứa ẵ nitrat (1/2N).
Mô tả thí nghiệm: Vi tảo H. lacustris được nuôi trong môi trường BBM ở điều kiện chiếu sỏng 35 àmol.m-2.s-1 và 250C đến khi tế bào H. lacustris ở trạng thái sinh dưỡng (80 – 90% tổng số tế bào) sẽ được chuyển sang các NT1, NT2, NT3, NT4, NT5 kết hợp với ánh sáng trắng ở cường độ ánh sáng 100 àmol.m-2.s-1.
c. Thí nghiệm 3: Thí nghiệm ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến vi tảo H.
lacustris trong pha tích lũy astaxanthin.
Mục tiêu thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của cường độ và các phổ ánh sáng đến sự tích lũy astaxanthin của H. lacustris.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. NT1:
Ánh sáng trắng, NT2: Ánh sáng xanh, NT 3: Ánh sáng đỏ
Mô tả thí nghiệm: Vi tảo H. lacustris được nuôi trong môi trường BBM ở điều kiện chiếu sỏng 35 àmol.m-2.s-1 và 250C đến khi tế bào H. lacustris ở
trạng thái sinh dưỡng (80 – 90% tổng số tế bào) sẽ được chuyển sang các NT1, NT2, NT3 ở cường độ 100 àmol.m-2.s-1.
d. Thí nghiệm 4: Thí nghiệm ảnh hưởng của axetat và sắt đến vi tảo H.
lacustris trong pha tích lũy astaxanthin.
Mục tiêu thí nghiệm: Đánh giá khả năng sử dụng acetat và sắt để kích ứng tích lũy astaxanthin ở vi tảo H. lacustris.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. NT1 (DC): Nước cất, NT2 (Ac): Nước cất có bổ sung acetat 30mM, NT3:
(axetat+Fe2+): Nước cất có bổ sung axetat 30mM + Fe2+ 300uM, NT4 (Fe):
Nước cất có bổ sung Fe2+ 300uM
Mô tả thí nghiệm: Vi tảo H. lacustris được nuôi trong môi trường BBM ở điều kiện chiếu sỏng 35 àmol.m-2.s-1 và 250C đến khi tế bào H. lacustris ở trạng thái sinh dưỡng (80 – 90% tổng số tế bào) sẽ được chuyển sang các NT1, NT2, NT3, NT4. Thí nghiệm được tiến hành dưới điều kiện cường độ ánh sáng trắng đèn LED 7000 lux, chế độ chiếu sáng liên tục. Mật độ (tb/ml) và đường kính tế bào (μm) được theo dõi sau 2h, 24h và 54h tính từ lúc bắt đầu thí nghiệm.
2.2.3. Phương pháp xác định khối lượng
Sự phát triển của tế bào được theo dõi bằng cách đo độ hấp thụ khác nhau ở hai bước sóng 680 nm và 750 nm với máy quang phổ UV/VIS (UV- 2802PC UNIC), khối lượng của tế bào được tính theo công thức:
Khối lượng = [-4.2 × {(OD680 - OD750)/OD680} + 1.4] × OD680
Tốc độ sinh trưởng của vi tảo H. lacustris được tính dựa trên kết quả khối lượng tế bào thu được ở các nghiệm thức thí nghiệm. Tốc độ sinh trưởng được tính theo công thức của Han Shun và cộng sự (2016):
μ = (lnNt - lnN0) / t
Trong đó:
Nt là khối lượng tế bào tại t ngày nuôi (g/L) N0 là khối lượng tế bào lúc bắt đầu nuôi cấy (g/L) 2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng sắc tố
5ml tảo H. lacustris được mang đi li tâm ở 10.000 vòng/ phút trong vòng 5 phút, sau đó loại bỏ dịch nổi thu lấy cặn tế bào. Cặn sau đó được tái hòa tan trong 2 ml methanol 96%, vortex trong vòng 30 giây để hòa tan hoàn toàn cặn tế bào. Mẫu được li tâm 10000 vòng/ phút trong vòng 5 phút và thu phần dịch nổi. Tiếp tục lặp lại bước li tâm thu dịch cho đến khi phần dịch nổi trở nên trong suốt. Phần dịch nổi thu được sẽ được sử dụng để xác định hàm lượng sắc tố bằng máy đo quang phổ UV-VIS.
Đo OD ở các bước sóng 470, 653, 666 nm (Máy Jasco V750). Hàm lượng các sắc tố được tính theo công thức được nêu ra bởi Lichtenthaler &
Wellburn [32].
Hàm lượng sắc tố quang hợp P = Cx1000/TB
Trong đú: P là hàm lượng sắc tố trong 1 tế bào (àg/tb), TB là số tế bào trong thể tích tảo đem đi ly tâm để tách chiết, C là giá trị nhận từ các công thức sau:
Sắc tố Giá trị C
Chlorophyll a C = 15,65 x E666 - 7,34 x E653 Chlorophyll b C = 27,05 x E653 - 11,21 x E666
Carotenoid C = (1000 x E470 - 2,86 x Ca - 129,2 x Cb)/221 Với Ex là giá trị OD đo được ở bước song x.
Nhiều công trình cho thấy hàm lượng carotenoids tổng số được xem chủ yếu là astaxanthin. Hàm lượng astaxanthin chiếm 85 – 88% carotenoids tổng số [57]. Do vậy với giới hạn của điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi sử
dụng thông số carotenoid tổng số như đặc trưng cho hàm lượng astaxanthin trong vi tảo H. lacustris.
2.4.5. Phương pháp đếm tế bào và đo kích thước tự động
Dùng pippete trộn đều mẫu cần đếm, pha loãng mẫu (nếu cần thiết) và nhỏ một lượng cần thiết (10àl) chia đều vào mỗi buồng đếm, đậy lamen sao cho lamen không lệch ra khỏi buồng đếm, không có bọt khí, sau đó đặt buồng đếm lên kính hiển vi. Điều chỉnh tiêu cự của kính hiển vi quang học và tiến hành quan sát ở vật kính 10X để tìm được buồng đếm trên thị trường, điều chỉnh ốc vi cấp để quan sát tế bào rõ hơn. Tiến hành chụp hình và xác định mật độ, kích thước tế bào bằng phầm mềm IMAGEJ.
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm R (R Development Core Team, 2010). Phân tích phương sai 1 yếu tố (ANOVA) được áp dụng để đánh giá sự sai khác có ý nghĩa giữa các nghiệm thức, giá trị p <0,05 được xác định là có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%.
CHƯƠNG 3.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN