Ảnh hưởng của sự thiếu hụt dinh dưỡng đến vi tảo H.lacustris trong pha tích lũy astaxanthin

4. Nội dung nghiên cứu

3.2. Ảnh hưởng của sự thiếu hụt dinh dưỡng đến vi tảo H.lacustris trong pha tích lũy astaxanthin

Đã có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra giới hạn về các yếu tố dinh dưỡng như nguồn nitrat và phosphat là yếu tố chìa khóa cho tổng hợp và tích lũy astaxanthin [26].

3.1.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo H.lacustris.

Vi tảo H.lacustris khi được nuôi ở trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau có mật độ khác nhau ở thời điểm kết thúc thí nghiệm. Nhìn chung, mật độ đều có sự tăng lên ở các nghiệm thức thiếu hụt dinh dưỡng so với ban đầu, trừ ở môi trường dinh dưỡng BBM. Kết quả được thể hiện ở hình 3.2.

Hình 3.2. Mật độ tế bào ở các nghiệm thức dinh dưỡng vào lúc bắt đầu và kết thúc thí nghiệm

Cụ thể, sau 8 ngày nuôi vi tảo đạt mật độ cao nhất ở môi trường không chứa nitrate(0N) với mật độ đạt 16855 ± 3930 tb/ml, cao hơn đáng kể so với mật độ ban đầu (6636 ± 1256 tb/ml), với giá trị p=0,0007 < 0,05. Tương tự, ở

nghiệm thức 0P cũng ghi nhận sự tăng mật độ từ 7673 ± 144 tb/ml lên 14182

± 2805 tb/ml (p=0,05). Sự thay đổi mật độ tế bào ở các nghiệm thức còn lại là không có ý nghĩa thống kê, với giá trị mật độ chỉ tăng từ 10566 ± 1409 tb/ml lên 14465 ± 3077 tb/ml ở nghiệm thức 0P, tăng từ 9654 ± 2499 tb/ml đến 11485 ± 1776 tb/ml ở nghiệm thức N/2 và giảm từ 9758 ± 2028 tb/ml xuống còn 6918 ± 1462 tb/ml trong nghiệm thức BBM (các giá trị p-value < 0,05).

Hình 3.3. Đường kính tế bào ở các nghiệm thức dinh dưỡng vào lúc bắt đầu và kết thúc thí nghiệm

Về kích thước, đường kính của các tế bào quan sát được có sự sụt giảm ở các nghiệm thức hoàn toàn không có nitrate (0N và 0N0P), ngược lại tăng lên ở các nghiệm thức còn lại. Tuy nhiên, sự dao động kích thước này lại không có ý nghĩa về mặt thống kê (p>0,05). Đường kính trung bình của tế bào ở các nghiệm thức đều nằm trong khoảng từ 17,5 - 21 μm.

Có thể nhận thấy rằng, trong pha tích lũy, khi tảo được chuyển từ môi trường BBM sang môi trường thiếu hụt dinh dưỡng, sự sinh trưởng của tảo vẫn được duy trì sau 8 ngày. Kết quả nghiên cứu này so với nghiên cứu của Harker.M năm 1996 về ảnh hưởng của hàm lượng nitrate đến sinh trưởng và tích lũy thì có sự khác biệt. Harker báo cáo rằng hàm lượng nitrate cao nhất

tương ứng với mức tăng mật độ tăng cao nhất trong khi ở nghiệm thức không bổ sung nitrate mật độ tảo giảm đáng kể [18]. Sự khác biệt này có thể được giải thích bởi thí nghiệm của Harker được tiếng hành ở một pha, có nghĩa rằng ngay ban đầu ông đã tiến hành nuôi vi trảo trong những môi tường với hàm lượng khác nhau đểu theo dõi cả về tốc độ sinh trưởng và tích lũy. Còn nghiên cứu này được tiến hành thành hai pha tách biệt, vi tảo được nhân sinh khối trong môi trường đầy đủ sau đó mới chuyển sang môi trường bị thiếu hụt dinh dưỡng khác nhau, vậy nên kết quả của hai nghiên cứu mới khác biệt.

Bên cạnh đó, điều kiện chiếu sáng ở hai nghiên cứu không giống nhau, ở nghiờn cứu ụng Harker,.M chiếu sỏng ở cường độ 35 àmol.m-2.s-1 cũn nghiờn cứu này được thức hiện trong điều kiện chiếu sỏng 100 àmol.m-2.s-1. Vậy nờn khi chiếu sáng cao kết hợp với thiếu hụt dinh dưỡng thì vi tảo sẽ được bảo vệ bởi cơ chế hình thành lớp thành tế bào dày bởi những hạt lipit để bảo vệ tế bào trước những điều kiện bất lợi [53]. Hơn nữa, khi môi trường không được bổ sung nitrate thì nitrate nội bào sẽ được kích ứng sản sinh để hỗ trợ sự sống của tế bào thậm chí còn sử dụng để sinh trường bình thường trong một vài giờ [13]. Vì vậy, quá trình sinh trưởng phát triển, điều này đã làm cho mật độ ở nghiệm thức này tăng lên. Còn ở nghiệm thước bổ sung nitrate chỉ chiếu sáng ở cường độ ánh sáng cao dinh dưỡng vẫn đầy đủ thì chưa kích ứng được tế bào diễn ra cơ chế chống lại với điều kiện chiếu sáng trong thời gian đầu, do vậy một số tế bào đã bị mất diệp lục khi không hình thành được cơ chế bảo vệ tế bào điều này khiến cho tốc độ sinh trưởng thấp hơn so với nghiệm thức 0N.

3.1.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến hàm lượng sắc tố trong tảo H.lacustris.

Vi tảo H.lacustris khi nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng khác nhau thì hàm lượng sắc tố tổng hợp được sẽ khác nhau (hình 3.4).

Hình 3.4. Sự thay đổi về hàm lượng chlorophyll a,b; carotenoids trong 1ml (mg/ml) ở các nghiệm thức dinh dưỡng vào lúc bắt đầu và kết thúc thí nghiệm

Hàm lượng carotenoids đa số ở các nghiệm thức đều tăng mạnh trừ

nghiệm thức BBM. Sự tăng lên của hàm lượng carotenoid trung bình ghi nhận được trong 1 ml dịch nuôi tảo sau 8 ngày tích lũy xấp xỉ bằng 4 mg/ml ở 2 nghiệm thức 0N và 0N0P. Ở nghiệm thức 0P, hàm lượng carotenoid tăng trung bình 2 ± 0,5 mg/ml trong khi lượng tăng ở nghiệm thức N/2 là thấp hơn (1,2 ± 0,4 mg/ml). Khi được cho tích lũy trong môi trường BBM, sự thay đổi của carotenoid là không đáng kể (p=0,99). Đối với chlorophyll a, hàm lượng của sắc tố này trong nghiệm thức 0P và N/2 được ghi nhận cao hơn đáng kể

sau 8 ngày tích lũy (p<0.05) trong khi ở các nghiệm thức còn lại có xu hướng giảm xuống với mức độ không lớn (p>0.05). Sắc tố Chlorophyll b không thay

đổi nhiều sau thời gian tích lũy ở hầu hết các nghiệm thức, riêng ở môi trường 0P, hàm lượng cao hơn 2 mg/ml so với ban đầu.

Sự gia tăng hàm lượng carotenoid, phần lớn là astaxanthin, của vi tảo H.

lacustris khi ở trong môi trường thiếu hụt dinh dưỡng đã được quan sát và báo cáo trong nhiều nghiên cứu. Kết quả từ nghiên cứu của Harker và cs., 1996 chỉ ra rằng sự thiếu hụt nitratevà phosphate trong môi trường nuôi cấy tiến làm hạn chế sự sinh trưởng của H. pluvialis nhưng lại thúc đẩy quá trình tổng hợp carotenoid trong loài tảo này [18]. Recht và cs (2014) báo cáo rằng hàm lượng carotenoid tổng số trong vi tảo H. lacustris tăng khoảng 0,07 mg/ml sau 48h kể từ khi được chuyển từ môi trường đầy đủ dinh dưỡng sang môi trường không có nitơ trong điều kiện ánh sáng cao [49]. Tương tự, Zhang et al., 2018 cũng đã khảo sát ảnh hưởng của nitơ lên sự tích lũy astaxanthin ở H. lacustris, kết quả cho thấy trong hàm lượng astaxanthin trong lô thí nghiệm cao hơn 1,64 lần (đạt 81,19 ± 3,26 với cường độ ánh sáng 400 μmol photons.m-2.s-1) so với lô đối chứng tại ngày thứ 11 của thí nghiệm [63].

Cường độ ánh sáng cũng có thể giúp giải thích cho sự thay đổi tỉ lệ sắc tố trong vi tảo trong thí nghiệm trên, bởi toàn bộ các nghiệm thức được chuyển sang điều kiện nuôi cấy có ánh sáng mạnh hơn trong pha tích lũy (100 μmol photons.m-2.s-1). Hàm lượng carotenoids đều tăng ở hầu hết các nghiệm thức do cơ chế bảo vệ tế bào bằng các hợp chất thứ cấp sẽ được kích thích hoạt động để thích nghi với điều kiện cường độ chiếu sáng lớn. Ngoài ra, trong điều kiện có nitrate trong môi trường nuôi (nghiệm thức 0P, N/2), cường độ ánh sáng cao kích thích sự tổng hợp chlorophyll a phục vụ cho việc quang hợp [38]. Hàm lượng chlorophyll a tăng mạnh hơn ở nghiệm thức 0P so với N/2 có thể được giải thích bởi mật độ trong 0P là cao hơn và lượng nito trong môi trường là nhiều hơn. Đối với tảo được nuôi trong môi trường BBM, sự thay đổi các sắc tố là không đáng kể.

Lưu ý rằng sự thay đổi hàm lượng sắc tố trong 1ml dịch tảo có thể là do sự thay đổi trong thành phần tế bào và/hoặc do sự thay đổi về mật độ. Để

đánh giá được sự tích lũy sắc tố của tế bào tảo, sự thay đổi hàm lượng của carotenoids, chlorophyll a và b trong 1 tế bào đã được khảo sát.

Hình 3.5. Sự thay đổi về hàm lượng chlorophyll a,b; carotenoids trong một tế bào (μg/tb) ở các nghiệm thức dinh dưỡng vào lúc bắt đầu và kết thúc thí

nghiệm

Sự biến động hàm lượng sắc tố ở mỗi tế bào H. lacustris trong sau 8 ngày kích thích tích lũy hầu hết là không có ý nghĩa thống kê, ngoại trừ

nghiệm thức môi trường không chứa nito (0N, 0N0P). Ở hai nghiệm thức này, lượng carotenoids trung bình trong một tế bào tăng lên rõ rêt (p-values <

0.05), lần lượt là tăng 0,19 ± 0,06 μg/tb và 0,27 ± 0,04 μg/tb. Đồng thời sự suy giảm của chlorophyll a và chlorophyll b cũng được ghi nhận, với mức độ giảm mạnh hơn và có ý nghĩa thống kê ở nghiệm thức 0N.

Kết quả này tương tự với kết quả trong nghiên cứu của Fabregas,. năm 2003, với hàm lượng chlorophyll giảm từ 25 pg/tb xuống còn 0.8 pg/tb trong

khi hàm lượng astaxanthin đạt cao nhất (340 pg/tb) trong điều kiện chiếu sáng cao kết hợp với không bổ sung nitrate [12]. Một xu hướng tương tự cũng được báo cáo bởi [42].

Kết quả này có thể được giải thích theo cơ chế sinh tổng hợp của các nhóm sắc tố. Nitrate là thành phần tham gia vào việc tổng hợp các hợp chất chlorophyll trong tế bào vi tảo, cho nên ở trong các nghiệm thức không chứa nitrate thì hàm lượng chlorophyll a giảm. Đồng thời, cường độ ánh sáng mạnh kích thích sự quang hợp của vi tảo khiến vi tảo cần nhiều hơn nito để thực hiện quá trình tăng sinh và sinh sản, do đó khi lượng nito ở môi trường không đủ, chlorophyll sẽ được sử dụng như là một nguồn nito dự trữ để duy trì sự sinh trưởng [38].

Đáng chú ý, sự suy giảm chlorophyll ở các tế bào tảo trong nghiệm thức 0N là mạnh hơn so với nghiệm thức 0N0P. Harker và cs (1996) đã nhấn mạnh rằng sự thiếu hụt về nitrate và phosphate đều gây ra sự tích lũy astaxanthin và suy giảm sinh trưởng ở vi tảo, tuy nhiên mức độ hạn chế lên tốc độ sinh trưởng do phosphate tạo ra là thấp hơn nhiều so với nitrate [18]. Phosphate được tế bào sử dụng để tổng hợp năng lượng ATP (Adenosine triphosphate) và các vật chất di truyền của vi tảo, là yếu tố cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển bình thường của các tế bào tảo [56]. Trong nghiên cứu này, ở nghiệm thức 0N vẫn có sự tăng lên đáng kể về mật độ trong khi môi trường thiếu cả nitratevà phosphate (0N0P), mật độ dường như không đổi. Do đó, Chlorophyll trong nghiệm thức 0N giảm mạnh là do (1) không có sự tổng hợp thêm, (2) mất đi để duy trì sinh trưởng và (3) do sự phân chia tế bào, còn trong nghiệm thức 0N0P, lý do chính chỉ là (1) và (2).

3.3. Ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến vi tảo H. lacustris trong pha tích lũy

3.3.1. Ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến mật độ và kích thước của vi tảo H.lacustris

Vi tảo khi được nuôi cấy dưới phổ ánh sáng khác nhau: trắng, xanh, đỏ ở cường độ 100 àmol.m-2.s-1 đều cho thấy sự tăng lờn về mật độ sau 4 ngày nuôi. Ở 2 nghiệm thức ánh sáng trắng và đỏ mật độ ở ngày cuối xấp xỉ nhau, lần lượt là 43658 ± 6494 tb/ml và 46069 ± 10326 tb/ml. Ở ánh sáng xanh mật độ vẫn tăng nhưng thấp hơn so với 2 nghiệm thức còn lại chỉ tăng từ 16016 ± 4051 tb/ml lên 34515 ± 5492 tb/ml. Kết quả này cho thấy ở ánh sáng trắng và đỏ, tảo sinh trưởng tốt hơn.

Hình 3.6. Mật độ vi tảo ở các nghiệm thức phổ ánh sáng vào lúc bắt đầu và kết thúc thí nghiệm

Về kích thước, đường kính của tế bào giảm sau 4 ngày nuôi cấy ở cả 3 nghiệm thức, Cụ thể giảm từ 19,9 ± 0,5 μm xuống 17,3 ± 0,3 μm ở ánh sáng đỏ, giảm từ 20,2 ± 0,26 μm xuống 17,4 ± 0,8 μm ở ánh sắng xanh và giảm từ

19,5 ± 0,19 μm xuống 16,77 ± 0,69 μm ở ánh sáng trắng. Kết quả phân tích phương sai ANOVA cho thấy các sự suy giảm kích thước này đều có ý nghĩa thống kê (p-values < 0.05).

Hình 3.7. Kích thước tế bào vi tảo ở các nghiệm thức phổ ánh sáng vào lúc bắt đầu và kết thúc thí nghiệm

Ở các nghiệm thức đều ghi nhận sự tăng lên về mật độ tế bào và giảm xuống của kích thước tế bào, điều này có thể được giải thích là do sự sinh sản của tế bào trưởng thành tạo thành nhiều tế bào non có kích thước nhỏ hơn.

Hiện tượng này được quan sát rõ rệt dưới kính hiển vi.

Nhiều đề tài đã thực hiện khảo sát ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến tốc độ sinh trưởng của vi tảo H.lacustris kết quả nêu ra rằng ánh sáng đỏ và trắng thích hợp cho sự sinh trưởng của vi tảo hơn ánh sáng xanh[24], [28]. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến sự sinh trưởng vi tảo của Katsuta (2004) là ở cường độ 8àmol.m-2.s-1 ỏnh sỏng trắng đạt 0,7 mg/cm2, ỏnh sỏng đỏ 0,6 mg/cm2và ánh sáng xanh 0,4 mg/cm2 [24]. Kết quả ở ánh sáng trắng

đạt mật độ cao nhất tiếp theo là ánh sáng đỏ, ánh sáng xanh cho mật độ thấp nhất. Vậy kết quả này tương tự với kết quả đã được nêu trên.

3.2.2. Ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến sự tích lũy sắc tố của vi tảo H.lacutris

Nhìn chung hàm lượng sắc tố trong 1ml dịch tảo đều tăng lên ở cả 3 nghiệm thức sau 4 ngày nuôi. Ở mỗi phổ ánh sáng khác nhau sẽ có sự thay đổi về hàm lượng các nhóm sắc tố là khác nhau. (Hình 3.8).

Ở ánh sáng trắng, hàm lượng của tất cả các nhóm sắc tố đều tăng, với lượng chlorophyll a tăng 4,07 ± 1,3 mg/ml, chlorophyll b tăng 6,3 ± 0,5 mg/ml và hàm lượng carotenoics tăng 4,3 ± 0,23 mg/ml (p>0,05), tăng cao hơn so với 2 nhóm còn lại. Ở ánh sáng đỏ, hàm lượng chlorophyll a tăng 3,2 ± 0,5 mg/ml, chlorphyll b tăng 4,4 ± 0,78 mg/ml và carotenoids tăng 1,03 ± 0,4 mg/ml. Tương tự ánh sáng xanh dương cũng tăng lên ở hàm lượng chlorophyll a,b lần lượt là 3,23 ± 0,52 mg/ml và 6,4 ± 0,7 mg/ml, carotenoids

tăng lên 1,02 ± 0,74 mg/ml.

Hình 3.8. Sự thay đổi về hàm lượng Chlorophyll a,b; Carotenoids trong 1 ml (mg/ml) ở các nghiệm thức phổ ánh sáng vào lúc bắt đầu và kết thúc thí

nghiệm

Hình 3.9. Sự thay đổi về hàm lượng chlorophyll a,b; carotenoids có trong 1 tế bào (μg/tb) ở các nghiệm thức phổ ánh sáng vào lúc bắt đầu và kết thúc thí

nghiệm

Lưu ý rằng sự thay đổi hàm lượng sắc tố trong 1ml dịch tảo có thể là do sự thay đổi trong thành phần tế bào và/hoặc do sự thay đổi về mật độ. Để

đánh giá được sự tích lũy sắc tố của tế bào tảo, sự thay đổi hàm lượng của carotenoids, chlorophyll a và chlorophyll b trong 1 tế bào đã được khảo sát.

Trên đơn vị 1 tế bào, hàm lượng các nhóm sắc tố của vi tảo sau khi nuôi cấy trong những điều kiện ánh sáng khác nhau cũng có sự thay đổi so với ban đầu. Kết quả trong hình 3.9 cho thấy ánh sáng trắng dường như kích thích tích lũy carotenoids ở các tế bào trong khi ánh sáng xanh thúc đẩy sự tổng hợp chlorophyll b, còn ánh sáng đỏ lại làm giảm đáng kể chlorophyll a.

Hình 3.10. Phổ hấp thụ ánh sáng của các sắc tố và phổ phát xạ ánh sáng của các loại đèn LED (ảnh có chỉnh sửa từ https://www.philpoteducation.com/)

Kết quả này có thể được giải thích dào phổ hấp thụ ánh sáng của các sắc tố, phổ phát xạ của các màu đèn LED và cường độ ánh sáng. Trong nghiệm thức sử dụng ánh sáng màu xanh dương (bước sóng 450 – 500nm) kích thích tích lũy, carotenoids và đặc biệt là chlorophyll b có khả năng hấp thụ nhiều photons nhất trong dải bước sóng này, nên hàm lượng 2 sắc tố này chiếm ưu thế trong tế bào vi tảo. Ánh sáng của LED trắng có phổ khá rộng với các đỉnh phát xạ ở khoảng 465nm, 520nm và 640nm - phù hợp sự tổng hợp cả 3 loại sắc tố. Nghiên cứu này ghi nhận sự tăng lên đáng kể của carotenoid trong tế bào vi tảo ở ánh sáng trắng, điều này có thể do cường độ ánh sáng cao kích thích sự tổng hợp của các sắc tố bảo vệ. Đối với LED đỏ, phổ phát xạ là khoảng 620 – 670nm, phù hợp cho sự hấp thụ tối ưu của chlorophyll a và b, tuy nhiên kết quả chúng tôi lại cho thấy hàm lượng chlorophyll a giảm đáng kể.

Theo nghiên cứu của Kasuta.T đã thực hiện năm 2003, hàm lượng asatxanthin tích lũy trong vi tảo được nuôi ở ánh sáng xanh dương là cao nhất [24]. Một nghiên cứu khác cho rằng ánh sáng đỏ thích hợp cho việc nhân nhanh sinh khối sau đó chuyển sang ánh sáng xanh như là một yếu tố để kích

ứng tổng hợp Carotenoid thứ cấp [28]. Ở nghiên cứu của Ma.R (2018), ánh sáng xanh cho kết quả tổng hợp được astaxanthin cao nhất đạt 36 mg/g (TLK) ở ngày thứ 4, ở phổ ánh sáng trắng và đỏ không có sự chênh lệch rõ rệch và hàm lượng astaxanthin giảm dần từ ngày thí nghiệm thứ 2 [35].

Các kết quả trong thí nghiệm này cho thấy xu hướng thay đổi của hàm lượng sắc tố theo phổ ánh sáng, tuy nhiên, thời gian thực hiện thí nghiệm khá ngắn nên các sự thay đổi là không thực sự rõ ràng, do đó cần có những nghiên cứu sâu hơn và dài hơn.

3.4. Ảnh hưởng của axetat và sắt đến vi tảo H. lacustris trong pha tích lũy

3.4.1. Ảnh hưởng của axetat và sắt đến mật độ và kích thước của vi tảo H.

lacustris

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc bổ sung axetat, axetat+Fe2+, Fe2+

trong môi trường nuôi tảo có ảnh hưởng rõ rệt đến mật độ tế bào tảo (Hình 3.11).

Hình 3.11 Ảnh hưởng của axetat và Fe2+ đến mật độ tế bào vi tảo H. lacustris trong pha tích lũy