Để định hướng sử dụng chủng D3 làm chủng lên men sinh ethanol, chúng tôi tiến hành phân loại chủng này theo các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa và sinh học phân tử.
3.2.1. Phân loại theo Bergey
Kết quả quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên thạch đĩa (hình 3.4), hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử (hình 3.5), khả năng bắt màu Gram (hình 3.6).
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc chủng D3 trên môi trường thạch
MPA
Hình 3.5. Ảnh kính hiển vi điện tử tế bào
chủng D3 (độ phóng đại 10.0000 lần)
Hình 3.6. Hình thái tế bào chủng D3 dưới kính hiển vi điện tử
quang học
Bảng 3.3. Một số đặc điểm sinh học của chủng D3 TT Đặc điểm sinh học Kết quả
1 Nguồn gốc Dứa
2 Hính thái khuẩn lạc Trắng sữa, bề mặt bóng, dẹt, mép răng cưa 3 Hỡnh thỏi tế bào Que ngắn, đứng riờng rẽ, kớch thước 1x 0,4àm
4 Gram -
5 Hình thành bào tử -
6 Hiếu khí Tùy tiện
7 Khả năng di động +
8 catalaza +
9 Oxidase -
10 β - Glactosidase +
11 Indole production -
12 Gelatinase -
13 Urease -
14 Citrate +
15 Oxi hoá NO3 đến NO2 +
Khả năng lên men
D-Glucose +
D-Xylose + Sucrose + Rỉ đường +
Fructose + Mantose + Lactose + Inositol - Myo-Insitol +
Mannitol + D-Arabinose + L-Arabinose + L-Rhamnose -
Mannose +
D – Sorbitol +
Gluconate + Malate + Glycerol + 16
Arginine dihydrolase +
17 Nhiệt độ sinh trưởng 28 – 42oC
18 pH sinh trưởng 4 - 9.5
19 Chịu NaCl 0 – 7%`
Từ các kết quả về đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào VK dưới kính hiển vi điện tử, khả năng bắt màu Gram, và một số đặc điểm sinh lí, sinh hoá đã được trình bày, chủng VK D3 có nhiều đặc điểm giống với Enterobacter theo khoá phân loại vi khuẩn Bergey (1994).
Bên cạnh những phương pháp định loại VSV truyền thống, các nhà khoa học còn sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phân loại dựa trên trình tự gen. Đối với VK xác định trình tự gen 16S rARN là phương pháp đang được dùng phổ biến. Gen này có mặt trong tất cả các tế bào, chứa cả vùng bảo thủ cao và vùng biến đổi cho phép phân biệt giữa các loài khác nhau.
3.2.2. Phân loại chủng vi khuẩn D3 dựa trên trình tự gen 16S rARN
Hiện nay phương pháp sử dụng gen 16S rARN để phân loại vi khuẩn rất phổ biến và cho độ chính xác cao. Chủng D3 tiếp tục được nghiên cứu phân loại dựa trên trình tự gen 16S rARN.
3.2.2.1. Phân lập đoạn gen mã hoá 16S rARN từ ADN gen của D3
Tách chiết ADN tổng số là bước khởi đầu để tiến hành các thí nghiệm sinh học phân tử. Hình 3.7 trình bày kết quả điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số từ chủng D3 trên agaroza 0,8%.
Từ kết quả điện di cho thấy ADN tổng số tách chiết được có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR. Sử dụng cặp mồi đặc hiệu có trình tự đã trình bầy ở phần phương pháp, để nhân đoạn gen bảo thủ nhất trong gen 16S rARN chúng tôi tiến hành PCR để nhân đoạn gen mã hóa 16S rARN. Sản phẩm PCA thu được kiểm tra trên gel agaroza 0,8% và kết quả thu được thể hiện trong hình 3.8.
Kết quả điện di đồ trên hình 3.8 cho thấy sản phẩm PCR thu được 1 băng rất đặc hiệu. Kích thước phân tử vào khoảng 1,5 kb tương đương với tính toán lí thuyết.
Sản phẩm PCR này có độ tinh sạch cần thiết nên có thể được sử dụng trực tiếp cho thí nghiệm đọc trình tự tiếp theo.
3.2.2.2. Xác định trình tự gen 16S rARN của D3
Sản phẩm PCR sau tinh sạch được dùng trực tiếp để xác định trình tự nucleotit của gen 16S rARN (xem phụ lục). Các trình tự đã đọc được kiểm tra trong chương trình BioEdit, đây là một phần mềm chuyên chỉnh sứa các lỗi sai trong quá trình đọc trình tự. Sử dụng chương trình BLAST trong NCBI để so sánh các trình tự đã sửa chữa với trình tự đã công bố.
3.2.2.3. So sánh trình tự gen 16S rARN của D3 trên ngân hàng gen
Dựa trên kết quả giải trình tự và so sánh trên ngân hàng gen, cho thấy chủng vi khuẩn D3 có mức độ tương đồng 99% với các loài vi khuẩn thuộc chi Enterobacter.
Để biết mối quan hệ di truyền giữa các chủng, cây phát sinh chủng loại (hình 3.9) dựa trên phân tích phân đoạn gen 16S rARN đã được thiết lập theo chương trình điện toán MEGA 2.1.
Bảng 3.4. Mức độ tương đồng của chủng D3 với các loài trên GenBank
Accession Description Max
score
Total score
Query coverage
E value
Max ident HM217949.1 Enterobacter cloacae strain 2584 3154 99% 0.0 99%
Hình 3.8: Phổ điện di sản phẩm PCR Giếng 1: PCR - D3
Giếng 2: Thang Macker chuẩn Hình 3.7. AND tổng số
Giếng 1: AND - D3
Giếng 2: Thang Macker chuẩn
1 2 kb
1.5
1 2 kb
1
G35-1 16S rRNA gene GQ284539.1 Enterobacter sp. TSSAS2-
48 16S rRNA gene 2590 3160 99% 0.0 99%
HM218110.1 Enterobacter hormaechei subsp. steigerwaltii strain NM23-1 16S r RNA gene
2584 3154 99% 0.0 99%
EU603515.1 Bacterium DR172 16S rRNA gene
2584 3148 99% 0.0 99%
AB114268.1 Enterobacter sp. B901-2 gene for 16S rRNA
2582 3148 99% 0.0 99%
HM058581.1 Enterobacter hormaechei subsp. steigerwaltii culture- collection IMAU:80301 16S rRNA gene
2579 3148 99% 0.0 99%
Trên cây phát sinh chủng loại (hình3.9) cho thấy, chủng D3 phân lập tại Việt nam rất gần với Enterobacter cloacae (E.cloacae).
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại của chủng D3
Như vậy, dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa và so sánh trình tự gen mã hoá 16S rARN kết hợp với hệ thống phân loại VK của Bergey thì chủng D3 có thể được xếp vào chi Enterobacter và được đặt tên là Enterobacter sp.D3.
Để đánh giá được khả năng sinh ethanol cũng như các yếu tố liên quan đến khả năng này của chủng D3, các nghiên cứu tiếp theo cần được tiến hành.
D3 E.cloacae E.agglomerans E.hormaechei E.sakazakii P.luteola A.hydrophila E.coli
S.sonnei E.aerogenes K.phanticola E. gergoviae