Khả năng lên men phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: Chế độ nuôi cấy, các nguồn dinh dưỡng được sử dụng thay đổi trong môi trường. Do đó, việc cải thiện môi trường và điều kiện nuôi cấy là cần thiết để giảm chi phí.
Tiến hành lên men 96h với lượng cơ chất 3%, bổ xung giống 5% với mật độ tế bào OD(λ=620nm) = 2,46.
3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Chúng tôi tiến hành lên men tạo ethanol của chủng D3 được khảo sát trong một dải nhiệt độ khác nhau từ: 28, 30, 32, 35, 37 40 và 45°C. Mẫu lên men được lặp lại 3 lần. Kết quả tạo thành trong dịch lên men được thể hiện trong bảng 3.9 và hình 3.13.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng lên men ethanol của chủng D3
Glucoza Xyloza Nhiệt
độ
(oC) OD (λ=620nm) pH cuối %V ethanol
OD
(λ=620nm) pH cuối %V
Ethanol
28 0,30 ± 0,012 3,88 0,198 0,264 4,28 0,238
30 0,25 ± 0,022 3,87 0,213 0,292 4,17 0,242
32 0,257 ± 0,014 3,85 0,224 0,303 4,20 0,230
35 0,395 ± 0,017 3,81 0,239 0,271 4,24 0,212
37 0,207 ± 0,034 3,96 0,128 0,206 4,26 0,148
40 0,122 ± 0,015 4,02 0,076 0,171 4,48 0,096
45 0,114 ± 0,026 4,09 0,045 0,126 4,34 0,049
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Glucoza pH cuối Glucoza OD (l=620nm) Glucoza %V ethanol Xyloza pH cuối Xyloza OD (l=620nm) Xyloza %V Ethanol
Hình 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng lên men ethanol của chủng D3 Kết quả cho thấy chủng D3 lên men cho %V ethanol cao nhất trên nguồn glucose ở 350 C là 0,239%, từ 400C trở lên lượng ethanol sinh ra không đáng kể.
Đồng thời sinh khối giảm dần theo chiều tăng của nhiệt độ, số lượng tế bào ở 400, 450 C rất thấp. Trong suốt qúa trình lên men pH giảm và ổn định trong dải pH axit, điều này rất có lợi thế trong lên men trnhs hiện tượng tạp nhiễm. Vì vậy khi tiến hành lên men trên nguồn Glucose để thu sản phẩm, nhiệt độ nuôi nên ở 350C.
Chủng D3 lên men sinh ethanol có chiều hướng không giống nhau khi sử dụng nguồn cơ chất khác nhau, đồng thời nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và lên men của chủng cũng không giống nhau. Trên nguồn xylose %V ethanol cao nhất ở 300C là 0,242%, đây cũng là lúc mật độ tế bào tập trung cao nhất và pH xuống thấp nhất. Khi nhiệt độ lên cao thì cả sinh trưởng và kả năng lên men ethanol cảu chủng giảm dần. Vì vậy khi tiến hành lên men trên nguồn Xylose để thu sản phẩm, nhiệt độ nuôi nên ở 30ºC.
28 30 32 35 37 40 45 Nhiệt độ (0C)
OD(620nm) pH cuối
%V ethanol
3.4.2. Ảnh hưởng của pH
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên khả năng lên men ethanol của chủng nghiên cứu được trình bầy ở bảng 3.11 và hình 3.14.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của pH lên khả năng lên men ethanol của chủng D3
Glucose Xylose pH ban
đầu OD
(λ=620nm) %V ethanol
pH cuối
OD
(λ=620nm) %V
ethanol pH cuối
4 0,189 0,048 4,30 0,17 0,051 4,26
4,5 0,201 0,104 4,27 0,159 0,103 4,38
5 0,223 0,197 4,28 0,283 0,249 4,20
5,5 0,244 0,218 5,00 0,262 0,225 4,21
6 0,281 0,235 4,15 0,256 0,198 4,7
6,5 0,233 0,154 4,21 0,242 0,145 4,37
7 0,129 0,092 4,90 0,163 0,098 4,39
7,5 0,115 0,045 4,53 0,121 0,047 4,21
8 0,107 0,024 4,92 0,102 0,015 4,54
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
Glucose pH cuối Glucose %V ethanol Glucose OD (l=620nm) Xylose pH cuối Xylose %V ethanol Xylose OD (l=620nm)
Hình 3.14. Ảnh hưởng của pH lên khả năng lên men ethanol của chủng D3 Kết quả thu được cho thấy chủng D3 lên men ethanol tối đa ở môi trường có pH ban đầu 5,0 trên nguồn Xylose, sau đó đến môi trường có pH ban đầu 4,5. Ở các
4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8
pH ban đầu OD (620nm)
pH cuối %V ethanol
pH khác chủng này lên men thấp. Như vậy pH ban đầu thích hợp cho chủng lên men trên nguồn Xylose là 5,0.
Trên nguồn glucose chủng D3 sinh ethanol cao nhất ở pH ban đầu 6, sau đó đến môi trường có pH ban đầu 5,5. Ở các môi trường có pH ban đầu là 7; 7,5 và 8 chủng này sinh trưởng yếu và lên men thấp. Như vậy pH thích hợp cho lên men trên nguồn glucose là pH ban đầu 6.
3.4.3. Động thái lên men ethanol
Các kết quả nghiên cứu trên cho phép lựa chọn được môi trường và các điều kiện lên men thích hợp cho chủng VK nghiên cứu.
Kết qủa nghiên cứu động thái lên men sinh ethanol của chủng VK D3 trên nguồn cơ chất là Glucose cho thấy lượng sinh khối trong 20h đầu chưa cao, mật độ tế bào tăng dần trong các giờ tiếp theo và đạt cực đại sau 92h, hàm lượng ethanol đạt cực đại sau 96h là 0,228 %V. Ở 92h %V ethanol cho giá trị không chênh lệch nhiều so với thời điểm 96h, vì vậy để giảm chi phí năng lượng thì thời gian tốt nhất để lên men ethanol đối với nguồn glucose sau 92h. Trên nguồn xylose hàm lượng ethanol đạt cực đại là 0,256%V ở cùng thời điểm 92h, lúc này mật độ tế bào cũng đạt giá trị cực đại. So sánh cho thấy trên nguồn xylose chủng D3 lên men nhanh hơn và tạo ra ethanol cao hơn khi sử dụng nguồn glucose. Cả hai nguồn cho %V ethanol cao nhất sau 92h lên men.
Bảng 3.11. Động thái lên men ethanol của chủng vi khuẩn D3
Glucose Xylose Thời gian
(h) OD
(λ=620nm)
%V Ethanol
OD (λ=620nm)
%V Ethanol
0 - - - -
12 0,132 0,041 0,130 0,056 18 0,140 0,085 0,145 0,095 20 0,241 0,168 0,249 0,167 24 0,245 0,187 0,241 0,189 28 0,248 0,195 0,240 0,197
44 0,350 0,201 0,334 0,205 48 0,351 0,206 0,335 0,216 68 0,352 0,212 0,337 0,223 72 0,355 0,217 0,341 0,235
92 0,362 0,227 0,353 0,256
96 0,359 0,228 0,392 0,249
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4
Xylose %V Ethanol - Xylose OD (l=620nm) Ethanol - Glucose OD (l=620nm) - Glucose %V Ethanol -
Hình 3.15. Động thái lên men ethanol của chủng vi khuẩn D3 3.4.4. Ảnh hưởng của lượng giống tiếp
Lượng giống tiếp được tiến hành trên cơ sở nhân giống lên men cấp I và cấp II.
Giống cấp I được nuôi cấy trong 24h, nhân giống cấp II, sau 24h tiến hành thu sinh khối và lên men, các ống lên men được tiếp với lượng giống khác nhau.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng lượng giống lên khả năng lên men ethanol của chủng D3
Glucose Xylose Lượng
giống tiếp (%)
OD
(λ=620nm) %V ethanol
pH cuối
OD
(λ=620nm) %V ethanol
pH cuối
2 0,170 0,228 4,25 0,170 0,225 4,26
3 0,189 0,231 4,24 0,179 0,237 4,38
4 0,213 0,235 4,33 0,224 0,240 4,20
5 0,226 0,237 4,24 0,236 0,252 4,21
6 0,359 0,239 4,21 0,262 0,249 4,27
7 0,362 0,250 4,16 0,359 0,250 4,37
12 18 20 24 28 44 48 68 72 92 96 Thời gian (h)
OD (620nm)
%wt ethanol
8 0,370 0,249 4,18 0,363 0,248 4,39
9 0,381 0,248 4,24 0,375 0,248 4,21
10 0,405 0,250 4,29 0,412 0,249 4,54
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
Glucose OD (l=620nm) Glucose %V ethanol Glucose pH cuối Xylose pH cuối Xylose %V ethanol Xylose OD (l=620nm)
Hình 3.16. Ảnh hưởng lượng giống lên khả năng lên men ethanol của chủng D3 Kết quả cho thấy lượng giống tiếp 2% - 4% hàm lượng ethanol thu được là tương đương nhau trên cả 2 nguồn đường. Khi tiếp giống 5% - 7% thì lượng ethanol có sự thay đổi đáng kể, ở 5% giống trên nguồn cơ chất Xylose đạt 0,252%V ethanol, ở 7% giống trên nguồn Glucose đạt 0,250%V ethanol. Trên 8% giống lượng ethanol sinh ra trên cả hai nguồn đường lượng ethanol tạo ra là tương đương nhau và có chièu giảm xuống. Chính vì thế lượng giống tiếp 5 – 7% được chúng tôi sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Vi khuẩn thường chịu ảnh hưởng rất nhiều từ nguồn cacbon trong môi trường.
Nếu biết được đặc điểm sử dụng nguồn cacbon của chủng nghiên cứu sẽ có cơ sở khoa học để lựa chọn các nguồn nguyên liệu trong quá trình nhân giống, nuôi cấy, lên men.
Glucose, xylose, rỉ đường và sucrose, với hàm lượng 1-5% được chọn để nghiên cứu. Riêng glucose và xylose nghiên cứu rộng hơn với hai nồng độ 7,5% và 10%. Kết quả được trình bày ở bảng 3.14 và hình 3.17 cho thấy chủng VK này có
8
2 3 4 5 6 7 9 10
Lượng giống tiếp (%) OD(620nm)
pH cuối
%V ethanol
khả năng đồng hóa tất cả các nguồn cacbon được kiểm tra. Khi tăng hàm lượng đường glucose từ 1% đến 4% thì %V ethanol trong mẫu cũng tăng với tỷ lệ thuận, tới hàm lượng đường 5% thì %V ethanol đạt hàm lượng cao nhất 0,203% V. Sau đó hàm lượng ethanol cũng không tăng mặc dù hàm lượng glucose tiếp tục tăng. Trong môi trường chứa xylose, rỉ đường và sucrose chiều hướng lên men diễn ra tương tự và hàm lượng ethanol đạt cao nhất ở nồng độ nguồn cacbon 4%; 3% và 3% lần lượt là 0,203% V; 0,197% V và 0,208% V tương ứng.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên quá trình lên men của chủng D3 Nguồn
Cacbon Nồng độ (%) pH cuối OD
(λ=620nm) % V ethanol
1 3,21 0,31 0,176
2 3,55 0,32 0,180
3 3,77 0,32 0,182
4 3,15 0,35 0,189
5 3,88 0,47 0,200
7,5 3,86 0,46 0,197 Glucose
10 3,96 0,46 0,198
1 3,26 0,33 0,181
2 3,12 0,41 0,188
3 3,94 0,45 0,193
4 3,82 0,55 0,203
5 3,21 0,50 0,197
7,5 4,55 0,51 0,198 Xylose
10 4,77 0,52 0,198
1 3,57 0,42 0,166
2 3,15 0,49 0,187
3 3,88 0,51 0,197
4 3,86 0,45 0,178
Rỉ đường
5 3,96 0,48 0,175
1 3,83 0,50 0,179
Sucrose
2 3,65 0,51 0,185
3 3,57 0,62 0,198
4 3,56 0,59 0,197
5 3,74 0,52 0,196
Các kết quả trên xác định xylose 4% là nguồn cacbon tốt nhất cho lên men ethanol của chủng D3.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
pH cuối OD (l=620nm)
% V ethanol
Hình 3.17. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên quá trình lên men của chủng D3 3.4.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Cùng với nguồn cacbon, nitơ là nguồn dinh dưỡng không thể thiếu và có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và lên men ethanol của VSV.
Nguồn nitơ được khảo sát với các nồng độ khác nhau lần lượt là: 0,05; 0,1;
0,15%. Kết quả được trình bày ở bảng 3.15 và hình 3.18. Kết quả thu được cho thấy chủng nghiên cứu đều sử dụng được cả 4 nguồn nitơ. Nguồn và hàm lượng nitơ tối ưu là 0,1% (NH4)2SO4 cho hàm lượng ethanol cao nhất trên cả hai nguồn cacbon glucose và xylose lần lượt là 0,170%V và 0,238%V. Urea tỏ ra không thích hợp cho lên men ethanol của chủng nghiên cứu.
1 2 3 4 5 7,5 10 1 2 3 4 5 7,5 10 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Nguồn cacbon (%)
Glucose Xylose Rỉ đường Sucrose
OD (620nm) pH cuối
%V ethanol
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên quá trình lên men ethanol chủng D3
Glucose Xylose Nguồn
nitơ
Nồng độ
(%) OD
(λ=620nm) %V ethanol
pH cuối
OD
(λ=620nm) %V ethanol
pH cuối
0,05 0,283 0,135 4,88 0,412 0,228 4,80
0,1 0,395 0,165 5,07 0,262 0,238 4,91 (NH4)2SO4
0,15 0,463 0,170 5,29 0,342 0,234 4,91
0,05 0,471 0,123 4,78 0,314 0,157 5,91
0,1 0,362 0,168 4,05 0,204 0.184 5,20 NH4NO3
0,15 0,342 0,165 5,10 0,347 0,174 4,53
0,05 0,394 0,162 4,23 0,389 0,166 4,55
0,1 0,336 0,169 4,78 0,273 0,172 5,04 NH4Cl
0,15 0,342 0,153 5,00 0,294 0,163 5,16
0,05 0,365 0,145 4,67 0,311 0,098 4,70
0,1 0,303 0,164 4,59 0,395 0,172 4,67 Urea
0,15 0,271 0,165 5,92 0,294 0,169 5,56
0 1 2 3 4 5 6
Glucose pH cuối Glucose OD (l=620nm) Glucose %V ethanol
Hình 3.18. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên quá trình lên men xylose chủng D3
0,05 0,1 0,15
0,05 0,1 0,15 0,05 0,1 0,15 0,05 0,1 0,15
(NH4)2SO4 NH4NO3 NH4Cl Urea
OD(620nm) pH cuối
% V ethanol
Nguồn nitơ (%)
0 1 2 3 4 5 6
Xylose pH cuối Xylose OD (620nm) Xylose %V ethanol