Laccase xúc tác oxy hóa cơ chất điển hình là p-dihydroxy phenol ho c là hợp chất phenol khác đồng thời khử oxy thành nước. Laccase xúc tác phổ cơ chất rất rộng bao gồm các diphenol, các polyphenol ho c các hợp chất có bản chất tương tự phenol như các diamine, amin thơm, hợp chất mạch vòng thơm dễ oxi hóa khác và các benzenethiol [56]. Một số loại cơ chất phenol thông dụng cho laccase bao gồm 3,5- dimethoxy-4-hydroxybenzaldehyde azine (syringaldazine, SYR), 1-naphtol, p-cresol (1-hydroxy-4-methylbenzene), 2,6-dimethoxyphenol (DMP) và 2-methoxyphenol (guaiacol, GUA) ho c hợp chất đƣợc sản sinh khi tham gia phân huỷ hợp chất lignin.
Thurston [54] đã chứng minh rằng hydroquinone và catechol là những cơ chất chính của laccase, guaicol và DMP thường phản ứng tốt hơn, P-phenylene diamine là cơ chất đƣợc sử dụng rộng rãi còn syringaldazine là cơ chất đ c hiệu của laccase. Vì vậy, laccase có khả năng xúc tác oxi hóa các monophenol, các diamine và một loạt các hợp chất mạch vòng phenol.
Hình 1.1. Cơ chế xúc tác phânhủy các ti u phần phenol của lignin b i laccase[15]
Khi bị oxy hoá bởi laccase, cơ chất bị mất một điện tử và hình thành một gốc tự do.
Sau đó gốc không bền này có thể tiếp tục bị oxi hóa bởi laccase (biến đổi phenol thành quinine) ho c tiếp tục tham gia phản ứng không đƣợc xúc tác bởi enzyme nhƣ hydrat
20
hóa, phản ứng oxi hóa khử ho c phản ứng trùng hợp [54]. Quá trình oxy hóa lignin bởi laccase đƣợc mô tả nhƣ trong hình 1.4.2.1, theo đó, các tiểu phần phenol trong cấu trúc phân tử lignin bị oxy hóa bởi laccase và tạo ra các gốc tự do phenoxy. Các gốc oxy hóa này có thể tiếp tục bị cắt khỏi mạch, đƣợc cacbonyl hóa ho c polyme hóa [54].
Laccase từ Cerrena unicolor và T. versicolor oxy hoá các hợp chất meta-phenol ở mức độ khác nhau. Trong khi laccase từ C. unicolor oxi hoá mạnh các hợp chất para- phenol [24] thì laccase từ T. versicolor có khả năng oxi hoá các hợp chất ortho-phenol [31]. Các nghiên cứu so sánh về tính chất laccase của nấm cho thấy tất cả các laccase đều có khả năng oxy hoá axit methoxyphenolic nhƣng ở các mức độ khác nhau. Hai hợp chất có nguồn gốc từ các hydroquinone là 2-methoxy-1,4-benzohydroquinone và 2,6-dimethoxy-1,4-benzohydroquinone cũng đã đƣợc chứng minh là bị oxy hoá bởi laccase từ nấm Pleurotus eryngii [27].
Nhiều thuốc nhuộm sử dụng hiện nay thuộc nhóm phenolic, chúng có khả năng bị oxy hóa bởi laccase.
1.4.2.2. Xúc tác chuy n hóa các hợp chất khác
Laccase cũng có thể oxy hóa các hợp chất không có bản chất phenol (non-phenolic) khi có m t chất chuyển điện tử trung gian (mediator) thích hợp (Hình 1.24.2.2A). Cơ chế xúc tác của hệ thống laccase - mediator bắt đầu bằng việc laccase oxy hóa chất trung gian chuyển chất trung gian về dạng oxy hóa; sau đó các hợp chất trung gian đã đƣợc oxy hóa tiếp tục thực hiện phản ứng oxy hóa khử với cơ chất tạo sản phẩm (Hình 1.4.2.2B2). Hiện nay, có hơn 200 chất chuyển điện tử trung gian đã đƣợc tìm thấy trong đó ABTS, HBT (1- hydroxybenzotriazole), guaiacol, syringaldazine là các chất chuyển điện tử trung gian được sử dụng rộng rãi nhất. Các chất chuyển điện tử trung gian lý tưởng phải là một cơ chất tốt của laccase, cấu trúc dạng oxi hóa và dạng khử của chúng phải ổn định nhƣng không ức chế hoạt tính enzyme. Các chất chuyển điện tử trung gian phải có thế oxi hóa khử cao và có thể thực hiện các phản ứng xúc tác phức tạp mà không bị giảm hoạt tính hóa học. Theo nghiên cứu của Sa´nchez và cs cho thấy syringaldazine và ABTS có thế oxi hóa khử cao nhất tương ứng khoảng từ 800 – 873mV [49]. Laccase thường hoạt động phối hợp với các enzyme khác, làm tăng hiệu quả của quá trình phân giải. Các nghiên cứu vẫn
21
đang đƣợc tiếp tục tiến hành để làm sáng tỏ vai trò của laccase trong quá trình phân giải này, đ c biệt là trong quá trình phân giải lignin. Bên cạnh đó, vai trò khử độc của dịch thủy phân cho mục tiêu lên men ethanol của laccase cũng đƣợc khẳng định. Laccase có khả năng loại bỏ các hợp chất phenol trong dịch thủy phân cao nhất trong số các enzyme thử nghiệm, chỉ sau nhựa trao đổi ion [20].
A
B
Hình 1.2. Cơ chế xúc tác phân hủy các ti u phần kh ng có bản chất phenol b i laccase [14; 17]
A. Cơ chế xúc tác oxi hóa của laccase với chất chuyển điện tử trung gian (mediator), B. Oxy hóa tiểu đơn vị không có bản chất phenol của lignin với sự tham gia của chất
chuyển điện tử trung gian 1.4.2.3. Xúc tác khử màu thuốc nhuộm
Laccase đƣợc nghiên cứu là có khả năng khử màu thuốc nhuộm sử dụng trong ngành công nghiệp dệt may dệt may từ những năm 1995 bởi Chivukula và Renganathan[18]. Năm 2005, cơ chế đề xuất sự phân hủy của hai loại thuốc nhuộm của laccase đƣợc đƣa ra bởi Andrea Zille[59].
Với thuốc nhuộm I, ban đầu laccase thực hiện quá trình oxy hóa một điện tử của amin thứ ba và loại hoàn toàn hydro (Hình 1.34.2.3.2). Sau đó laccase khử methyl và
Formatted Table
Formatted: Font: Bold, Not Italic Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold, Not Italic Formatted: Font: 13 pt, Bold, Not Italic Formatted: Font: 13 pt, Bold Formatted: Indent: First line: 0"
22
oxy hóa min thứ hai trong nhóm azo của thuốc nhuộm chứa các nhóm này. Nước tấn công vào ái nhân ở vòng cacbon phenolic mang nhóm liên kết azo gây ra sự phân tách của liên kết N – C và tạo ra axit 3-diazenylbenzenesulfonic và 4-methylimino- cyclohexa-2,5-dienone. 3 - axit diazenyl-benezenesulfonic mất một phân tử nitơ để sinh ra gốc axit benzensulfonic, tại đây có thể hydro của phân tử oxy bị cắt để bổ sung sang cho phân tử nitơ ho c quá trình trùng hợp xảy ra giữa các phân từ thuốc nhuộm với nhau. Tuy nhiên cơ chế này vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ hoàn toàn.
23
Hình 1.3. Cơ chế đề xuất sự phân hủy thuốc nhuộm I b i laccase
24
Với thuốc nhuộm II (Muối natri axit sulfonic 3 - (2-hydroxy-naphthalen-1- phenylazo) – benzen), laccase oxy hóa nhóm phenolic của thuốc nhuộm azo với sự tham gia của một electron để tạo ra một gốc phenoxy, nơi này tiếp tục xảy ra quá trình oxy hóa để oxy hóa một ion cacbonium (Hình 1.4.2.3.3). Các ái nhân bị tấn công bởi nước vào vòng phenolic cacbon mang liên kết azo để tạo ra axit 3-diazenyl- benzensulfonic và 1,2-naphthoquinone. Lúc này vai trò của laccase không đƣợc thể hiện mà thay vào đó là vai trò của các gốc tự do, chúng có thể đƣợc sinh ra từ quá trình oxy hóa một điện tử của thuốc nhuộm II bởi laccase. Các gốc tự do sẽ phản ứng với 1,2-naphthoquinone, chứ không phải là bị oxy hóa.Các gốc hình thành có thể trải qua quá trình oxy hóa để mang lại chất VIII, X ho c vừa trùng vừa oxy hóa để tạo thành hợp chất IX.
25
Hình 1.4. Cơ chế đề xuất sự phân hủy thuốc nhuộm II b i laccase
26 4 Tính chất của laccase
Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4 – 6 đối với cơ chất phenolic. Khi tăng pH sang vùng trung tính ho c vùng kiềm thì hoạt tính của laccase bị giảm, nguyên nhân do anion nhỏ là ion hydroxide đã ức chế laccase. M t khác, tăng pH còn làm giảm thế oxy hóa khử của các cơ chất phenolic do đó cơ chất phenolic dễ bị oxy hóa bởi laccase hơn. Do vậy, hoạt tính laccase ở các pH khác nhau là kết quả của hai tác dụng đối lập của pH là sự tăng chênh lệch thế oxy hóa khử laccase – cơ chất và tác dụng ức chế trung tâm đồng ba nguyên tử của ion hydroxide. Đối với các cơ chất không phải phenolic nhƣ ABTS thì phản ứng oxy hóa không liên quan đến sự vận chuyển ion và do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2 – 3. Ngƣợc lại, tính bền của laccase cao nhất đa phần trong khoảng pH kiềm nằm trong khoảng 8 – 9. Độ bền nhiệt của laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của vi sinh vật. Nhìn chung, laccase bền ở 30 – 50oC và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 60oC. Laccase bền nhiệt nhất đƣợc phân lập chủ yếu từ các loài thuộc prokaryotae, ví dụ thời gian bán hủy của laccase của Streptomyces lavendulae là 100 phút ở 70oC và của protein cotA từ loài Bacillus subtilis là 112 phút ở 80oC. Thời gian bán hủy của laccase có nguồn gốc nấm thường là nhỏ hơn 1 giờ ở 70oC và dưới 10 phút ở 80oC [34; 37].