PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1.1. Xác định sinh khối nấm mốc

Lấy 100ml canh trường lỏng, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch, thu sợi nấm. Sợi nấm đƣợc rửa sạch trên giấy lọc đã đƣợc xác định khối lƣợng và sấy ở nhiệt độ 1050C đến trọng lƣợng không đổi. Sinh khối nấm mốc đƣợc biểu diễn bằng số gam trọng lượng khô của sợi nấm trong mỗi lít canh trường.

2.2.1.2. Xác định hoạt độ enyzme[40]

* Hoạt độ laccase

Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzyme cần thiết đ xỳc tỏc oxy húa 1àmol ABTS trong 1 phút 270C trong dung dịch đệm acetatnatri pH 5.

Mẫu thớ nghiệm:Gồm 850 àl dung dịch đệm acetate natri 0,1M pH 5, 100 àl ABTS 1mM. Ủ hỗn hợp này ở 270C trong 10 phỳt. Bổ sung 50 àl enzyme. Trộn đều hỗn hợp.

Mẫu ki m chứng: 900 àl dung dịch đệm acetate 0,1M pH 5, bổ sung 100 àl ABTS 1mM. Ủ hỗn hợp này ở 270C trong 10 phút. Trộn đều hỗn hợp.

Đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch ở bước sóng 420nm sau mỗi 1 phút trong vòng trong 10 phút. Hoạt độ laccase đƣợc tính theo công thức:

(2.1)

Trong đó:

Formatted: Line spacing: 1.5 lines

Formatted: Indent: Left: 0"

Formatted: Font: 13 pt, Not Bold

35 Vt : Tổng thể tích phản ứng (ml) Vs: Thể tích enzyme phản ứng (ml)

ΔEmax: Sự thay đổi độ hấp thụ cực đại của dịch phản ứng trong 1 phút ở bước sóng 420nm

:Hệ số hấp thụ riờng , 0,036 àM-1cm-1

*Manga peroxydase (MnP)[47]

Một đơn vị hoạt độ MnP là lượng enzyme cần thiết đ xúc tác oxy hóa phenol đỏ trong 1 phút 300C trong dung dịch đệm acetate 0.2M, pH 4.5.

Mẫu thớ nghiệm gồm 500 àl đệm acetat natri 0.2M pH 4.5, bổ sung 100 àl phenol đỏ 0.1%, 20àl MnS04 5mM và 360 àl enzyme. Mẫu kiểm chứng gồm 860 àl đệm acetat natri 0.2M pH 4.5, bổ sung 100 àl phenol đỏ 0.1%, 20àl và MnS04 5mM. Ủ hỗn hợp này ở 300C trong 10 phỳt. Bổ sung 20 àl H2O2 5mM. Trộn đều hỗn hợp. Xỏc định hoạt độ mangan peroxydase bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch ở bước sóng 610 nm sau 5 phút.

Hoạt độ = (U/l) V1: Tổng thể tớch (1000 àL) V2: Thể tớch enzyme (500 àL) 5 : Thời gian phản ứng (phút) ε = 0.022 àM-1cm-1

*Lignin peroxydase (LiP)[55]

Một đơn vị hoạt độ LiP là lượng enzyme cần thiết đ xỳc tỏc oxy húa 1àmol eratryl alcohol trong 1 phút 250C trong đệm tartrate natri 0.162M, pH 3.

Mẫu thớ nghiệm gồm 740 àl đệm tartrate natri 0.162M, pH 3, bổ sung 40 àl veratryl alcoolol 60 mM và 400 àl enzyme. Ủ hỗn hợp này ở 300C trong 10 phỳt. Bổ sung 20 àl H2O2 16.4 mM để bắt đầu phản ứng. Trộn đều hỗn hợp.Xỏc định hoạt độ lignin peroxydase bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch ở bước sóng 310 nm sau 1 phút.

Hoạt độ =

(U/l)

36 V1: tổng thể tớch 1200 àL

V2: thể tớch enzyme 400 àL ε = 0.0093 mM-1cm-1 Thời gian phản ứng: 60 giây

2.2.1.3. Phương pháp xác định hàm lượng thuốc nhuộm

Xây dựng đường chuẩn: Cân 0.01g thuốc nhuộm mỗi loại và cho vào 10 ml H20 cất để có một dung dịch có nồng độ thuốc nhuộm là 1g/lít. Từ dung dịch gốc này pha các dung dịch thuốc nhuộm độc lập tướng ứng với nồng độ các dung dịch là 10; 20;

30; 40; 50; 100 mg/lít. Đo ở các bước sóng hấp thụ cực đại của mỗi loại thuốc nhuộm và thiết lập đường chuẩn của thuốc nhuộm. Nồng độ của thuốc nhuộm trong dung dịch và nước thải được xác định khi đo độ hấp thụ tại các bước sóng tương ứng của thuốc nhuộm, so sánh với đường chuẩn. Các bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc nhuộm được đưa ra ở mục 2.1.2.Đường chuẩn của mỗi loại thuốc nhuộm được trình bày trong phụ lục 3.

Thuốc nhuộm đƣợc đánh giá nồng độ thông qua độ hấp thụ của dung dịch thuôc nhuộm tại bước sóng hâp thụ cực đại tương ứng của thuốc nhuộm.

2.2.1.4. Khảo sát các đ c tính cơ bản của enzyme Xác định pH tối ƣu và độ bền pH

Laccase đƣợc phân tích hoạt độ tại các pH từ 3, 4, 5, 6, 7 và8 (trong đệm citrate- phosphate0,1M và sodium phosphat 0,2M)

Để xác định độ bền pH của enzyme, dung dịch laccase đƣợc ủ trong đệm phosphate pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 trong 6h giờ ở 270C. Sau mỗi giờ, xác định hoạt độ laccase còn lại ở điều kiện tiêu chuẩn. Đánh giá độ bền laccase theo % hoạt độ laccase còn lại so với hoạt độ enzyme xác định theo điều kiện chuẩn.

Xác định nhiệt độ tối ƣu và độ bền nhiệt

Laccase đƣợc xác định hoạt độ tại các nhiệt độ trong dải từ 300C - 600C với đệm axetatnatri 0,1 M, pH 5.

Để xác định độ bền nhiệt của enzyme, enzyme đƣợc ủ tại các nhiệt độ kiểm tra trong 7 giờ trong đệm axetat natri 0,1 M, pH 5. Cứ sau mỗi giờ, xác định hoạt độ

enzyme ở điều kiện tiêu chuẩn. Đánh giá độ bền enzyme theo % hoạt độ laccase còn lại so với đối chứng (hoạt độ enzyme xác định theo điều kiện chuẩn).

2.2.1.5. Phương pháp xác định COD

COD là lượng oxy cần thiết để oxy hóa hóa học các hợp chất hữu cơ trong nước thành CO2 và H2O.

Nguyên tắc:

Hầu hết các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa khi được gia nhiệt trong môi trường chứa K2Cr2O7 (ho c KMnO4) và acid sulfuric, các ống nghiệm chứa hóa chất để oxy hóa các chất hữu cơ trong nước thải này đã có sẵn và tương ứng với các khoảng giá trị đo COD ước lượng sẽ có các ống nghiệm chứa hóa chất oxy hóa tương ứng. Khi đó các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa thành CO2 và H2O. Sau quá trình oxy hóa kết thúc tiến hành so màu trong máy Lovibond Checkit Direct COD vario, màn hình của máy đo sẽ hiển thị thông số COD (mg/l).

Tiến hành:

- Ước lượng nồng độ COD trong mẫu nước thải để lựa chọn ống kiểm tra COD thích hợp:

+ LR: 0 – 150 mg/l, sử dụng mã 2420720 + MR: 0 – 1500 mg/l, sử dụng mã 2420721 + HR: 0 – 15000 mg/l, sử dụng mã 2420722.

Chuẩn bị mẫu:

Mở ống phản ứng với nắp trắng và thêm thể tích quy định (chắc Chắc chắn rằng thiết bị sử dụng nằm trong khoảng an toàn).

LR-/MR: 2ml mẫu nước thải HR: 0,2 ml mẫu nước thải

Chuẩn bị một mẫu nước trắng đã được khử ion (không có TOC) thay vì mẫu LR- /MR: 2ml, HR: 0,2 ml.

Nắp các ống nghiệm lại và đảo trộn một vài lần (ống nghiệm sẽ trở lên nóng trong quá trình đảo trộn) và phá mẫu trong các ống nghiệm trong 120 phút trong máy gia nhiệt ở nhiệt độ 1500C.Sau đó chuyển các ống nghiệm ra khỏi máy gia nhiệt để làm

mát xuống dưới 600C ho c ít hơn.Đảo trộn các ống nghiệm một vài lần trong khi còn ấm.Sau đó để các ống nghiệm làm mát ở nhiệt độ xung quanh trước khi đo.

2.2.1.6. Phương pháp xác định BOD

Nhu cầu oxy hóa sinh học là lƣợng oxy cần cung cấp để oxy hoá các chất hữu cơ trong nước bởi vi sinh vật.

Nguyên tắc:

Đo oxy tiêu thụ trực tiếp bởi vi khuẩn từ quá trình tiêu thụ oxy trong môi trường ở điều kiện nhiệt độ ổn định và khuấy đảo. Hàm lƣợng CO2 lên men bởi vi sinh vật sẽ đƣợc xác định bởi dung dịch KOH có chứa bên trong cái nút gasket trong chai.

Kết quả có sự đối lưu áp suất trong hệ thống và sẽ được đo đạc giá trị bởi thiết bị Lovibond OxyDirect thông qua các sensor và sẽ đƣợc hiển thị trên màn hình bằng mg/l.

Giá trị BOD sẽ được lưu trữ lại trong bộ nhớ và có thể được hiển thị bất kỳ thời gian nào mà không cần sử dụng yếu tố chuyển đổi nào.

Tiến hành:

Những khoảng thể tích cho các mẫu đo:

- Mức độ BOD của mẫu phụ thuộc vào số lƣợng hàm lƣợng chất hữu cơ hiện có, nó có thể cân nhắc thay đổi. Hệ thống đo BOD Lovibond OxiDirect đo độ chính xác thể tích của các mẫu và đo tương đương các khoảng trong bảng dưới (Bbảng 2.1).

Khoảng đo cao nhất của hệ thống là 0-4000 mg/l.

- Trước khi đo đưa mẫu đo về pH chuẩn = 7, đo thể tích mẫu ứng với BOD được cho trong bảng dưới.

- Bỏ que khuấy từ vào chai đo mẫu

- Nhỏ 3-4 giọt dung dịch KOH vào trong nút gasket cao su sau đó cài vào cổ chai.

- Đ t chai vào vị trí trên bản cảm ứng từ của thiết bị Lovibond OxyDirect BOD.

Sau đó đ t cả hệ thống vào trong tủ ổn nhiệt ở 200C trong 5 ngày.

Bảng 2: .1.Th tích mẫu lựa chọn với khoảng giá trị BOD

Formatted: Indent: First line: 0"

Comment [C2]: Dài quá, nên tóm gọn lại đƣa nguyên tắc và tên thiết bị/tên kít thôi

Formatted: Space Before: 0 pt

Formatted: Font: Not Bold

Formatted: Danh mục bảng, Left, Indent: First line: 0", Tab stops: Not at 0.49"

39 Khoảng BOD

(mg/l)

Th tích mẫu (ml)

Bổ sung Nitrification (giọt)

0-40 428 10

0-80 360 10

0-200 244 5

0-400 157 5

0-800 94 3

0-2000 56 3

0-4000 21,7 1

Nguyên tắc:

Giá trị BOD sẽ được lưu trữ lại trong bộ nhớ và có thể được hiển thị bất kỳ thời gian nào mà không cần sử dụng yếu tố chuyển đổi nào.

Giá trị đo:

Nếu giá trị đo đƣợc đ t ở 24h, thiết bị đo Lovibond OxiDirect BOD sẽ ghi lại các giá trị đo mỗi giờ. Khi đo giá trị trong khoảng 48h, giá trị đo BOD được lưu lại 2h một lần. Nếu giá trị đo trong khoảng từ 3-28 ngày, thì hàng ngày có một giá trị đƣợc đo và lưu lại.

Giá trị hiện hành và giá trị được lưu lại có thể được gọi ra bất cứ thời gian nào.

Formatted: Centered

Formatted: Space Before: 10 pt

40 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1.Thu nhận enzyme từ canh trường vi sinh vật

Ly tâm 200 ml canh trường nuôi cấy nấm mốc ở 10.000 vòng/phút, 40C trong thời gian 15 phút để loại sinh khối. Dịch enzymenem thô đƣợc cô đ c qua cột milipore 30 kDa.Thu dịch, xác định hoạt độ enzyme.

2.2.2.2. Thu nhận enzyme từ bã thải trồng nấmP. florida

Bã thải trồng nấm sò trắngđƣợc nghiền nhỏ và bổ sung đệm acetatnatri (cứ 1kg bã bổ sung 2 lít đệm), pH 5 ở 300C để trích ly enzymetrong 30 phút. Ly tâm dịch ở 10.000 vòng/phút, 40C trong thời gian 15 phút để loại sinh khối. Thu 1,8 lít dịch enzyme, kết tủa bằng (NH4)2SO4 bão hòa 80% ở 4C. Sau đó ly tâm dịch ở 3500 xg/phút, 40C trong 10 phút để thu tủa. Kết tủa đƣợc hòa tan hoàn toàn trong đệm natri acetate 0.1M, pH5,dịch enzyme đƣợc loại muối qua cột milipore 30 kDa, thu dịch, xác định hoạt độ enzyme.

2.2.2.3. Chọn lọc enzyme có khả năng khử màu thuốc nhuộm

Bổ sung enzyme vào dung dịch thuốc nhuộm nồng độ 50 mg/l cho tới nồng độ enzyme cuối trong phản ứng là 0.05; 0.1; 0.2; 0.5 U/ml. Thực hiện phản ứng ở 30oC trong thời gian 24h. Đo độ hấp thụ cực đại ánh sáng của dung dịch phản ứng ở các bước sóng tương ứng với thuốc nhuộm.Dung dịch enzyme có khả năng khử nhiều màu thuốc nhuộm đƣợc chọn để nghiên cứu điều kiện phản ứng khử màu.

2.2.2.4. Xác định điều kiện khử màu thuốc nhuộm bằng enzyme

Thực hiện phản ứng khử màu thuốc nhuộm nồng độ 50 mg/l ở các nồng độ enzyme 0.1; 0.2; 0.5; 1 U/ml, thời gian 0; 0.25; 0.5; 1; 2; 3; 4; 5; 24 h và tại các pH khác nhau từ 3 đến 8. Đánh giá khả năng khử màu thuốc nhuộm thông qua đo độ hấp phụ ánh sáng của dung dịch sau phản ứng.

2.2.2.5.Chọn lọc nấm có khả năng khử màu thuốc nhuộm Nuôi cấy nấm mốc và bổ sung thuốc nhuộm

Chủng nấm được nuôi trên môi trường rắn PDA sau 7 ngày nuôi cấy. Sau đó, 5 khoanh m t thạch chứa nấm mốc đường kính 0.8 cm được chuyển sang nuôi trong môi

trường lỏng Basalở 300C và lắc ở chế độ 180 vòng/ phút. Sau 12 ngày tiến hành bổ sung thuốc nhuộm Rb19.

Đánh giá khả n ng hấp thụ thuốc nhuộm trên sinh khối [13]

Canh trường sau khi xử lý thuốc nhuộm được lọc sinh khối. Sinh khối được rửa sạch bằng nước cất, sau đó được rửa sạch qua hỗn hợp nước cất với methanol; nước cất với ethanol; nước cất với acetone theo tỉ lệ thể tích 1:1. Sợi nấm sau đó bị dừng quá trình bởi NaOH 4M và nghiền nát bởi phương pháp siêu âm. Sau khi ly tâm dung dịch để loại sinh khối, dư lượng thuốc nhuộm được đo bởi bước sóng hấp phụ cực đại.

2.2.2.6. Xử lý nước thải với enzyme Mô hình xử lý

Hệ thống xử lý 1 lít đƣợc thiết kế bao gồm: máy sục khí, 2 bình cao vị và 1 bể phản ứng theo hình 32.2.

Formatted: Font: Not Bold

Hình 3.5.62.2. Hệ thốngthí nghiệm xử lý nước thải dệt nhuộm

(1: Đường sục khí; 2: Bình chứa nước thải Rb; 3: Bình chứa enzyme laccase; 4: Bể phản ứng; 5: Lọ chứa nước thải đầu ra))

44 Thiết lập điều kiện xử lý

Hệ thống đƣợc vận hành liên tục tại nhiệt độ phòng trong 24h, ở pH 7, DO trong hệ thống ổn định ở khoảng 7,3 mg/l. Nước thải NT1 được sử dụng để thử nghiệm khả năng xử lý nhờ laccase.

Hệ thống được bổ sung 990 ml nước thải và 10 ml laccase cho tới nồng độ cuối laccase trong bình phản ứng là 1U/ml. Hệ thống đƣợc đảo trộn nhờ khuấy và sục khí, vận hành theo phương thức đóng trong 3-4 h đầu tiên sau đó chuyển sang vận hành liên tục,khi đó, nước thải được cấp vào hệ thống với tốc độ dòng khác nhau: 225 ml/h;

300 ml/h; 400 ml/h. Dịch enzyme đƣợc bổ sung liên tục vào hệ thống. Đánh giá nồng độ thuốc nhuộm, độ màu, BOD, COD của nước thải dòng ra.

Hiệu quả xử lý đƣợc xác địnhtheo công thức Hiệu quả xử lý BOD (%):

. 100%

Hiệu quả xử lý COD (%):

. 100%

Hiệu quả khử màu:

( )

ồ ộ ố ộ ồ ộ ố ộ ồ ộ ố ộ

Formatted: Indent: Left: 0.1"

Cơ chế xúc tác của enzyme laccase