CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp xét nghiệm
2.4.3. Xác định Streptococci feacal
2.4.3.1. Nguyên tắc
- Đếm Streptococcus faecalis dựa trên việc lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua một màng lọc có kích thước lỗ 0,45m thích hợp đủ để giữ lại các vi khuẩn.
Màng lọc được đặt vào môi trường đặc chọn lọc chứa natri azid (để ngăn sự sinh trưởng của các vi khuẩn Gram âm) và 2,3,5 - triphenyltetrazoli clorua, thuốc nhuộm không màu, khuẩn đường ruột sẽ khử thuốc nhuộm này thành formazan màu đỏ.
- Các khuẩn lạc điển hình được mọc lên, có màu đỏ, màu hạt dẻ hoặc màu hồng ở trung tâm của khuẩn lạc, hoặc ở khắp mọi nơi.
- Nếu quan sát được khuẩn lạc điển hình, bước thử khẳng định là cần thiết, bằng cách chuyển toàn bộ khuẩn lạc qua màng rồi chuyển vào thạch mật asculin – azid, được làm nóng trước ở nhiệt độ 440C. Streptococcus faecalis thủy phân môi trường này trong 2h. Sản phẩm cuối cùng 6,7 – dihydroxycoumarin kết hợp với ion sắt (III) tạo hợp chất màu nâu vàng tới đen, khuếch tán vào môi trường.
2.4.3.2. Điều kiện thử
Dụng cụ
- Ống đong 500ml
- Cốc có mỏ 50ml, 250ml, 500ml
- Bình cồn
- Muỗng inox
- Panh, dao, kéo inox
Thiết bị
- Cân phân tích
- Máy vortex
- Tủ ấm 370C
- Nồi cách thủy
- Lò vi sóng
- Tủ cấy vô trùng
- Thiết bị lọc màng
- Màng lọc vô trùng có kích thước 0,2m
Môi trường, thuốc thử
- Bromocresol Purple azid broth (canh thang glucose)
- Thạch mật aesculin niatrua agar (bile aseculin agar) hoặc thạch TTC Natri azid (thạch Slanetz & Bartley).
- Thuốc thử oxi già (hydro peroxit)
- Thuốc nhuộm Gram 2.4.3.3. Tiến hành thử
Chuẩn bị môi trường và thuốc thử
Chuẩn bị mẫu
Tốt nhất là bắt đầu phép thử ngay sau khi lấy mẫu. Nếu mẫu được giữ ở nhiệt độ môi trường (trong tối và không quá 250C) việc kiểm tra nên tiến hành ngay trong vòng 6h kể từ khi lấy mẫu. Trường hợp đặc biệt có thể lưu giữ ở (53)0C đến 24h trước khi kiểm tra.
Các bước tiến hành
- Bước 1: Lọc 250ml (hoặc 100ml) nước bằng màng lọc
- Bước 2: Đặt màng lọc lên trên đĩa thạch Slanetz và Bartley, đảm bảo không có không khí ở phía dưới.
- Bước 3: Ủ 370C/24h – 48h.
- Bước 4: Khẳng định và đếm
Sau khi ủ, coi tất cả các khuẩn lạc đã mọc có màu nâu đỏ hoặc màu hồng từ trung tâm hoặc toàn khuẩn lạc là điển hình.
Nếu có khuẩn lạc điển hình, dùng kẹp vô khuẩn chuyển màng lọc và khuẩn lạc mà không đảo xuống trên đĩa thạch mật – aesculin – azid đã được làm nóng trước ở 440C.
Ủ ở 440C 0,50C trong 2 giờ.
Đọc đĩa ngay lập tức.
Xem tất cả các khuẩn lạc điển hình có màu từ nâu đến đen ở môi trường bao quanh là phản ứng dương tính và đếm chúng như là khuẩn lạc Streptococcus faecalis.
2.4.4 Xác định Pseudomonas aeruginosa: Phương pháp thử ISO 16266 - 2006: Chất lượng nước - Phát hiện và định lượng Pseudomonas aeruginosa - Phương pháp lọc màng
2.4.4.1 Thiết bị
- Tủ ấm
- Bộ lọc với màng lọc cú kớch thước lỗ Φ = 0,47 àm
- Kẹp Inox
- Ống đong thủy tinh
- Hộp lồng petri.
2.4.4.2 Môi trường
- Centrimite agar
- King’s B agar
- Acetamide agar
- Thạch dinh dưỡng
- Thuốc thử Oxidase, thuốc thử Nessler 2.4.4.3 Tiến hành phân tích
Lọc mẫu: Đong lượng mẫu cần lọc bằng ống đong có độ chính xác tin cậy.
Nuôi mẫu:
Sau khi lọc xong, dùng panh vô khuẩn lấy màng lọc đặt lên đĩa thạch CAN đã chuẫn bị sẵn, sao cho mặt trên của màng lọc hướng ra ngoài thạch. Chú ý: không để xuất hiện bọt khí dưới màng lọc. Đặt đĩa thạch nằm cân bằng 10 phút.
Đặt đĩa thạch vào tủ ấm 370C và kiểm tra màng lọc sau 22±2h và sau 44±2h.
Kiểm tra màng lọc:
Đếm tất cả các khuẩn lạc sinh sắc tố màu xanh chính là P.aeruginosa
Kiểm tra màng lọc dưới đèn UV. Đếm tất cả các khuẩn lạc không sinh sắc tố và các khuẩn lạc hơi đỏ
Chú ý: việc chiếu đèn UV quá lâu có thể giết chết vi khuẩn
Khẳng định:
Đối với khuẩn lạc sinh sắc tố xanh không cần khẳng định sinh hóa
Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ lên thạch dinh dưỡng: Ủ 370C/22±2h
Kiểm tra phản ứng Oxidase
Dùng que cấy Platinum 5 lấy khuẩn lạc nghi ngờ cho lên miếng giấy vô khuẩn, nhỏ 1-2 giọt thuốc thử Oxidase.
Sau 10 giây nếu xuất hiện màu xanh tím: Oxidase (+)
Môi trường King’s B:
Cấy tất cả khuẩn lạc có Oxidase (+) vào môi trường King’s B
Ủ, 370C/24h
Đặt dưới đèn UV và kiểm tra: khuẩn lạc sinh sắc tố huỳnh quang được xem là King’s B (+)
Phản ứng sinh Amoniac:
Cấy khuẩn lạc có Oxidase (+) vào môi trường Acetamide broth
Ủ,370C/22±2h
Nhỏ 1-2 giọt thuốc thử Nessler, nếu xuất hiện màu từ vàng đến đỏ thì phản ứng được xem là Amoniac (+)
2.4.4.4 Kết quả
Tổng số vi khuẩn sinh sắc tố xanh trên CAN + khuẩn lạc có Oxidase (+), King’s B (+), Amoniac (+).