2.1. Vật liệu nghiên cứu
Nắm cộng sinh địa y được phân lập từ mẫu địa y Nigrovothelium tropicum thu tại thành phó Quang Ngãi, tinh Quang Ngãi (15.1042N, 108.8060E) vào tháng 4 năm
2023.
Hình 2.1. Mẫu địa y ¿V. tropicum được thu tại thành phố Quang Ngãi,
tinh Quang Ngãi
2.2. Thiết bị và dung cu
Dé tai có sử dụng những những thiết bị và dụng cụ như sau:
Bảng 2.1. Danh sách thiết bị dùng trong đề tài
".. "an.
Miyao Fann
Micropepette 10 pL
Micropepette 100 wL ;
Scilogex Micropepette 200 tt
Micropepette 1000 wL
Máy cô quay chân không Heidolph
Cân phan tích điện tr Sartorius
12 | Máy đọc đĩa BMG L.abtech
13
Các hoá chất sử dụng trong đề tài được trình bay trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Danh sách hóa chất được sử dụng trong đề tài
p-Nitrophenyl-D- glucopyranoside
- Sigma-Aldrich
a-Glucosidase (từ
Saccharomyces cerevisiae)
Ethyl acetate 99,5% AR Trung Quốc Dimethyl sulfoxide VWR International Pháp
Guangdong Guanghua Trung Quéc
Sci-Tec Co., Ltd.
Sucrose
Malt extract
Yeast extract
13 | Muller-Hinton Agar _ iMedia
2.3. Phuong phap
T Media
2.3.1. Phương pháp phân lập nắm cộng sinh địa y
Quy trình phân lập nắm cộng sinh địa y được tham khảo từ tài liệu [41]. trình
bày trong hình 2.2.
14
Ngâm mẫu trong côn 70°
khoảng 9 giiy
Rus đướit vòi nước
15 phút
Rửa mẫu 3 Gn
bằng nước cất vỏ trùng
Tach quả thế chứa bào tử năm cộng sinh
Nam cộng sinh với địa y ra khỏi địa v
hằng dao m5 và để lên
lim kính tiệt tròng
Nuôi cấy trong tối với
nhiệt độ 18°C (+2|
Nuéi cấy trong Hút bằng micropipette
môi trường MYA (+100g đường}
Quan sat dưới kính hiến vi
Um bảo tr
Hình 2.2. Sơ đồ mô tả quy trình phân lập nam cộng sinh dia y
Sau khi thu thập, mẫu địa y được làm sạch dưới vòi nước chảy liên tục trong
khoảng 15 phút. Sau đó, địa y được ngâm trong còn 70° trong 90 giây, tiếp đó là dung địch NaOCl 4% trong 5 phút đẻ tiệt trùng mẫu. Sau khi tiệt trùng, mẫu được rửa 3 lần
bằng nước cất và dé khô tự nhiên trong tủ cay. Qua thé được tách ra khỏi địa y bang
dao tiệt trùng, cắt thành lát mỏng va dé lên lam kính đã tiệt trùng; soi trên kính hiển vi dé xác định bảo tử nam. Sau khi được xác định, bao tử nắm cộng sinh địa y được hút bằng micropipette và chuyên lên các đĩa môi trường MYA. Các đĩa này được ủ trong tdi ở nhiệt độ 18 + 1°C.
2.3.2. Phương pháp nuôi nắm cộng sinh địa y
Nam địa y sau khi được phân lập, được chuyên sang nuôi cấy trong tôi với nhiệt độ 18 + 1°C trên các môi trường có thành phan như trong Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần môi trường nuôi cấy nắm cộng sinh địa y
ae Malt-yeast Agar Khoai tay Sabouraud Tên môi '
trata 10% sucrose 4% D-glucose
8 (MY 10) (S4)
20 g malt extract 200 g khoai tay 40 g D-glucose
Thanh phần g yeast extract 10 g peptone4
40 g sucrose 20 g agar
2.3.3. Phuong phap tao cao thé ethyl acetate
15
Phương pháp tao cao ethyl acetate được tham khảo tir tai liệu [42], mô ta chỉ tiết
trong hình 2.3.
Thu nấm
Wo đúng thời gian của các nghiệm thức
Nghiền thành bột
Ngâm trong ethyl acetate
tỷ lẻ 1:1
Lọc hỗn hợp qua py lọc
Cô đặc bằng máy cô quay
ở 40°C
Hình 2.3. Sơ đồ mô tả quy trình tạo cao ethyl acaetate từ nam cộng sinh địa y Sau khi được loại bỏ khỏi thạch, nắm cộng sinh địa y được sây khô trong tủ sây ở nhiệt độ 45°C và nghiên thành bột sau khi khô hoàn toàn. Phan nam đã xay nhuyễn được mang đi cân, ghi nhận sinh khối nắm. Tiếp theo đó, sinh khối nắm được ngâm trong ethyl acetate với tỷ lệ 1:1; hỗn hợp được lọc qua giấy lọc và cô đặc bang máy cô quay ở 40°C. Sau khi đã bay hơi dung môi hoàn toàn, hỗn hợp được mang đi cân dé ghi nhận khối lượng cao.
2.3.4. Phương pháp khảo sát hoạt tinh sinh học
2.3.4.1. Hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase
Nguyên tắc của phương pháp được dựa theo cơ chế hoạt động của enzyme ơ- glucosidase. Enzyme a-glucosidase phân giải cơ chất pNPG thành p-nitrophenol, tao màu vàng cho hỗn hợp sau phản ứng. Khả nang hoạt động của chất ức chế enzyme a-
glucosidase tỷ lệ nghịch với lượng p-nitrophenol, như vậy nghĩa là sau phản ứng màu
vàng của hỗn hợp cảng nhạt chứng tỏ kha nang ức chế enzyme a-glucosidase của mẫu
càng cao [43].
Phương pháp khảo sát hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase dựa theo tai liệu [37]. Enzyme a-glucosidase (0,2 U/mL) và cơ chất (5,0 mM p-nitrophenyl-œ-D-
glucopyranoside) được hòa tan trong dung dịch đệm natri phosphate 100 mM có pH
16
là 6,9. Dau tiên, cao thé ethyl acetate từ nam cộng sinh dia y được pha loãng trong DMSO thành néng độ 200 pg/mL và thêm vào mỗi dia của dia 96 giếng 50 WL; sau đó mỗi giếng được thêm 40 uL enzyme và ủ ở 37°C trong 20 phút. Sau 20 phút, hỗn hợp được bỗ sung 40 pL cơ chất và tiếp tục ủ trong 20 phút ở 37°C dé phản ứng diễn
ra. Cuối củng, phản ứng được kết thúc bang cách cách thêm 130 pL Na;CO:
0,2M. Hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase được định lượng bằng cách đo độ hap
thụ ở bước sóng 405 nm. Tất cá các mẫu được phân tích ba lần ở 10 nòng độ khác
nhau xung quanh giá trị ICso.
Tỷ lệ phần trăm ức chế (%) được tính theo phương trình:
OD miu
OD đối cae x 100
Phan tram tre ché (%)=(1 -
Trong đó, OD mẫu là giá tri ODsos của hỗn hợp phan ứng khi có chat ức chế, OD đổi chứng là giá trị OD4os của hỗn hợp phản ứng khi không có chất ức chẻ.
2.3.4.2. Hoạt tính kháng khuẩn
Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuan của mẫu nắm phân lập được dùng trong đẻ tài là phương pháp khoanh giấy khuếch tán trong thạch theo Kirby-Bauer
được tham khảo từ tài liệu [44] và [45], được mô tả trong hình 2.4.
Chuẩn bị đĩa môi trường MHA pha theo đúng hướng dẫn
Pha hỗn dịch vi khuấn
10° vi khuấn/mL
Trải hỗn dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch
Đặt khoanh giấy thấm 1 mg cao chiết ethyl
acetate lên thạch
đĩa thạch được ủ ở 37 + 2 °C trong vòng 16 = 18 giờ
Hình 2.4. Sơ đồ mô tả quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Quy trình khảo sát hoạt tính khang khuân chủng S. aureus được tiến hành trong
đề tài như sau:
17
- Chuan bị đĩa thạch Mueller-Hinton (MHA): Các thành phần môi trường được cân một cách chính xác theo hướng dẫn và hòa tan vào nước cất vô trùng, đun sôi, kiểm tra pH trong khoảng từ 7,2 - 7.4; cuối cùng, môi trường được hap tiệt trùng. Sau
khi hap xong, trong lúc còn nóng, môi trường được đô vào đĩa Petri vô trùng với độ
day khoảng 4 mm và đợi đông đặc.
- Chuan bị chủng vi khuẩn S. aureus và pha hỗn dịch vi khuẩn nông độ 10° vi khuân/mL.
- Trải vi khuẩn lên đĩa thạch: huyền phù chứa vi khuẩn được trải đều lên bề mặt môi trường MHA, dé khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt giây thắm hợp chất chiết xuất từ địa y.
- Các khoanh giấy thấm chứa 1 mg hợp chất chiết xuất từ địa y được đặt lên mặt
thạch (mỗi dia có từ | đến 3 khoanh giấy): các đĩa thạch sau đó được lật ngược và ủ
ở 35 + 2°C trong vòng 16 - 18 giờ.
- Sau khi ủ, các đĩa thạch được lấy ra khỏi tủ ấm, hoạt tính kháng khuẩn được
xác định bằng cách đo đường kính vòng vô khuan tai các vị trí trong ứng của khoanh giấy (dùng thước đo từ mặt sau cia đĩa va không được mở nắp).
Thí nghiệm sử dụng mẫu đối chứng âm là DMSO.
18