Ba giai đoạn phản ứng PCR thực hiện trên máy luân- 123docz.net

Giai đoạn biến tính (denaturation): 920C - 980C

 Have You Eaten Cheddar Cheese Lately?Have You Eaten Cheddar Cheese Lately?

One of the most successful applications of recombinant One of the most successful applications of recombinant

DNA technology for foods is the production of chymosin, an DNA technology for foods is the production of chymosin, an

enzyme used in cheese making. Chymosin, when added to enzyme used in cheese making. Chymosin, when added to

milk, causes the curd to form.

 Chymosin, which was available only from the stomach of Chymosin, which was available only from the stomach of calves, was in limited supply due to a reduction in the veal calves, was in limited supply due to a reduction in the veal

industry and expansion of the cheese industry.

 Then the gene for chymosin production was incorporated Then the gene for chymosin production was incorporated into the DNA of both bacteria and yeasts. Pure chymosin into the DNA of both bacteria and yeasts. Pure chymosin

can now be made. The enzyme is identical to that produced can now be made. The enzyme is identical to that produced in the calf and the process itself adds no contaminants. The in the calf and the process itself adds no contaminants. The

FDA evaluated the safety of the process and the product FDA evaluated the safety of the process and the product itself in 1990 and ruled that the enzyme preparation was itself in 1990 and ruled that the enzyme preparation was

safe for human consumption.

 Since then, chymosin produced by recombinant DNA Since then, chymosin produced by recombinant DNA organisms has been widely used in making Cheddar organisms has been widely used in making Cheddar

cheese. Most Americans who have had a slice of Cheddar cheese. Most Americans who have had a slice of Cheddar

cheese since 1990 have eaten a product improved by cheese since 1990 have eaten a product improved by

biotechnology.

FF++ x F x F--

This cross is This cross is FERTILE FERTILE.. Progeny are Progeny are FF++

Transfer of Transfer of fertility fertility

occurs at a occurs at a much higher much higher frequency frequency than the than the transfer of transfer of bacterial bacterial markers markers

which occurs which occurs at a low

at a low frequency.

frequency.

FF-- x F x F-- This cross is This cross is STERILE STERILE..

FF++ x x FF++

This cross is This cross is FERTILE FERTILE

and it occurs and it occurs at a very

at a very

FF++ x F x F--

Progeny are Progeny are FF++

Low frequency Low frequency

of of

recombinant recombinant s. s.

Hfr x Hfr x FF--

Progeny are Progeny are FF--

High frequency High frequency

of of

recombinant recombinant s. s.

Tổng hợp kháng thể đơn dòng:

 * * Đây cũng là áp dụng của ngành di truyền phân tử Đây cũng là áp dụng của ngành di truyền phân tử mà cơ sở của nó cũng dựa trên di truyền vi khuẩn.

mà cơ sở của nó cũng dựa trên di truyền vi khuẩn.

Trong kỷ thuật này, người ta áp dụng kỷ thuật phối Trong kỷ thuật này, người ta áp dụng kỷ thuật phối

hợp tế bào để biến những tế bào lympho sản xuất hợp tế bào để biến những tế bào lympho sản xuất

kháng thể trở thành bất tử (có 2 cách : gây nhiễm tế kháng thể trở thành bất tử (có 2 cách : gây nhiễm tế

bào lynmpho với virus Epstein Barr, hay hoà nhập bào lynmpho với virus Epstein Barr, hay hoà nhập

tế bào lympho với tế bào ung thư tuỷ chuột), rồi tế bào lympho với tế bào ung thư tuỷ chuột), rồi

dùng kỷ thuật clone để chọn dòng tế bào sản xuất dùng kỷ thuật clone để chọn dòng tế bào sản xuất

kháng thể đặc hiệu cho một epitope kháng nguyên, kháng thể đặc hiệu cho một epitope kháng nguyên,

đó là kháng thể đơn dòng.

FF++ x F x F--

This cross is

This cross is FERTILEFERTILE.. Progeny are

Progeny are FF++

Transfer of fertility occurs at a Transfer of fertility occurs at a

much higher frequency than the much higher frequency than the

transfer of bacterial markers transfer of bacterial markers

which occurs at a low which occurs at a low

frequency.

FF-- x F x F-- This cross is This cross is STERILESTERILE..

FF++ x x FF++ This cross is This cross is FERTILEFERTILE and it occurs and it occurs at a very low efficiency.

at a very low efficiency.

FF++ x F x F-- Progeny are Progeny are FF++

Low frequency of recombinants.

Hfr x Hfr x FF-- Progeny are Progeny are FF--

High frequency of recombinants.

Kỉ thuật lấp ráp gen Kỉ thuật lấp ráp gen

 Được thực hiện như sau Được thực hiện như sau : :

 - Từ tế bào động vật mang gen sản xuất protein ta - Từ tế bào động vật mang gen sản xuất protein ta cần, tách gen nầy ra khỏi tế bào.

cần, tách gen nầy ra khỏi tế bào.

 -Gắn gen nầy trên một vector ( phage tải nạp hay -Gắn gen nầy trên một vector ( phage tải nạp hay plasmid).

plasmid).

 -Đưa vector vào tế bào E. coli. Tế bào E. coli sẽ -Đưa vector vào tế bào E. coli. Tế bào E. coli sẽ tăng sinh tạo nên quần thể tế bào mang gen sản tăng sinh tạo nên quần thể tế bào mang gen sản

xuất protein động vật mà ta cần.

 - Tinh chế protein nầy bằng phương pháp hóa lý. - Tinh chế protein nầy bằng phương pháp hóa lý.

 Như vậy với kỉ thuật trên , trong trong phòng Như vậy với kỉ thuật trên , trong trong phòng thí nghiệm luôn luôn có sẳn nguồn sản xuất protein thí nghiệm luôn luôn có sẳn nguồn sản xuất protein động vật ta cần, màkhông cần phải li trích từ tế bào động vật ta cần, màkhông cần phải li trích từ tế bào

động vật vừa khó, vừa đắc tiền.

Kỉ thuật PCR:

 Để thực hiện thử nghiệm nầy trước hết người ta phải tổng hợp nên những Để thực hiện thử nghiệm nầy trước hết người ta phải tổng hợp nên những primer tức là những đoạn ADN nhỏ bắt đầu và kết thúc của đoạn ADN đặc primer tức là những đoạn ADN nhỏ bắt đầu và kết thúc của đoạn ADN đặc

hieọu . hieọu .

 Để làm thử nghiêm PCR, trước hết người ta phải thực hiện phản ứng tổng Để làm thử nghiêm PCR, trước hết người ta phải thực hiện phản ứng tổng hợp những đọan ADN đặc hiệu ít ỏi của vi khuẩn gây bịnh nằm trong bịnh hợp những đọan ADN đặc hiệu ít ỏi của vi khuẩn gây bịnh nằm trong bịnh phẩm lên nhiều ngàn lần . Phản ứng được thực hiện bằng cách xử lý nhiệt phẩm lên nhiều ngàn lần . Phản ứng được thực hiện bằng cách xử lý nhiệt

độ để tách sợi xoắn kép của ADN đặc hiệu của vi khuẩn thành sợi đơn , sau độ để tách sợi xoắn kép của ADN đặc hiệu của vi khuẩn thành sợi đơn , sau

đó cho vào các primer cùng vói các base và acid nucleic, dỉ nhiên phải có đó cho vào các primer cùng vói các base và acid nucleic, dỉ nhiên phải có

men polimerase. Nhờ vậy các nhánh bổ sung của đoạn ADN đặc hiệu sẽ men polimerase. Nhờ vậy các nhánh bổ sung của đoạn ADN đặc hiệu sẽ

được tổng hợp.

 Thực hiện quá trình mở xoắn rồi tổng hợp các nhánh bổ sung của đoạn Thực hiện quá trình mở xoắn rồi tổng hợp các nhánh bổ sung của đoạn

ADN đăc hiệu nhiều lần cũng theo tuần tự như trên. Thế là ta có hàng ngàn ADN đăc hiệu nhiều lần cũng theo tuần tự như trên. Thế là ta có hàng ngàn

bản copy của đoạn gen đặc hiệu trong bịnh phẩm (gọi là các đoạn PCR).

 Giai đoạn kế tiếp là phát hiện các đoạn gen đặc hiệu này bằng cách điện di Giai đoạn kế tiếp là phát hiện các đoạn gen đặc hiệu này bằng cách điện di trên thạch hay phát hiện bằng ADN probe.

trên thạch hay phát hiện bằng ADN probe.

 Kỉ thuật PCR là thử nghiệm rất đặc hiệu và rất nhạy cảm, Ví dụ: trong bịnh Kỉ thuật PCR là thử nghiệm rất đặc hiệu và rất nhạy cảm, Ví dụ: trong bịnh phẩm của bịnh cùi, với kỷ thuật PCR, chỉ cần hiện diện một vi khuẩn cùi, phẩm của bịnh cùi, với kỷ thuật PCR, chỉ cần hiện diện một vi khuẩn cùi,

người ta cũng có thể phát hiện ra. Tuy nhiên vì thử nghiệm này đòi hỏi khá người ta cũng có thể phát hiện ra. Tuy nhiên vì thử nghiệm này đòi hỏi khá nhiều trang thiết bị cũng như thuốc thử đắc tiền, mà đến nay nay chưa được nhiều trang thiết bị cũng như thuốc thử đắc tiền, mà đến nay nay chưa được

áp dụng rộng rải. Có thể trong thập niên kế , kỉ thuật PCR sẽ trở nên phổ áp dụng rộng rải. Có thể trong thập niên kế , kỉ thuật PCR sẽ trở nên phổ

bieán hôn.

 Khi đưa bộ gen mồi nói trên vào một hỗn hợp ADN đã được Khi đưa bộ gen mồi nói trên vào một hỗn hợp ADN đã được tách chiết từ vi sinh vật, nếu ADN này có chứa các đoạn tách chiết từ vi sinh vật, nếu ADN này có chứa các đoạn

gen có trình tự các nucleotide bổ sung với trình tự của gen gen có trình tự các nucleotide bổ sung với trình tự của gen

mồi thì chúng sẽ cặp đôi với nhau và, sau đó, gen mồi được mồi thì chúng sẽ cặp đôi với nhau và, sau đó, gen mồi được

kéo dài về phía đầu 3' của nó nhờ ADN polymerase. Đoạn kéo dài về phía đầu 3' của nó nhờ ADN polymerase. Đoạn ADN đó, nhờ vậy, sẽ được nhân lên một cách đặc hiệu rất ADN đó, nhờ vậy, sẽ được nhân lên một cách đặc hiệu rất

nhiều lần; sau quá trình nhân lên, người ta sẽ tìm đoạn nhiều lần; sau quá trình nhân lên, người ta sẽ tìm đoạn

ADN này, thông thường nhất, bằng điện di trên gel agarose ADN này, thông thường nhất, bằng điện di trên gel agarose

và nhuộm bằng ethidium bromide. Như vậy, sau khi điện và nhuộm bằng ethidium bromide. Như vậy, sau khi điện di, nếu có b ng ADN chạy giống như b ng chuẩn thì điều ǎ ǎ di, nếu có b ng ADN chạy giống như b ng chuẩn thì điều ǎ ǎ

đó có nghĩa là có vi sinh vật cần tìm trong bệnh phẩm;

ngược lại, nếu không thấy b ng nào xuất hiện hoặc có ǎ ngược lại, nếu không thấy b ng nào xuất hiện hoặc có ǎ

những b ng không giống với b ng chuẩn thì có nghĩa là ǎ ǎ những b ng không giống với b ng chuẩn thì có nghĩa là ǎ ǎ

không có tác nhân gây bệnh cần tìm trong bệnh phẩm.

 Dựa trên nguyên tắc này, hiện nay, hầu như tất cả các vi Dựa trên nguyên tắc này, hiện nay, hầu như tất cả các vi sinh vật gây bệnh đều có thể tìm được nhờ PCR

sinh vật gây bệnh đều có thể tìm được nhờ PCR

 Dùng PCR cho những vi sinh vật chưa nuôi cấy nhân tạo được hoặc nuôi cấy rất khó kh n: Dùng PCR cho những vi sinh vật chưa nuôi cấy nhân tạo được hoặc nuôi cấy rất khó kh n: ǎǎ

 . Các xoắn khuẩn: tất cả các xoắn khuẩn đều khó nuôi cấy.. Các xoắn khuẩn: tất cả các xoắn khuẩn đều khó nuôi cấy.

 Tác nhân gây bệnh giang mai (Treponema pallidum)Tác nhân gây bệnh giang mai (Treponema pallidum), hiện nay vẫn chưa nuôi cấy nhân tạo được. , hiện nay vẫn chưa nuôi cấy nhân tạo được.

Người ta có thể dùng nước ối từ mẹ làm bệnh phẩm cho PCR (1). Nhờ vậy, giang mai bẩm sinh có Người ta có thể dùng nước ối từ mẹ làm bệnh phẩm cho PCR (1). Nhờ vậy, giang mai bẩm sinh có thể được chẩn đoán rất sớm.

thể được chẩn đoán rất sớm.

 Người ta cũng đã dùng PCR để tìm gen mã hoá cho protein màng ngoài (2) hoặc một đoạn 419-bp Người ta cũng đã dùng PCR để tìm gen mã hoá cho protein màng ngoài (2) hoặc một đoạn 419-bp (3) của gen mã hoá protein lông của các tác nhân gây bệnh Lyme (Borrelia burgdorferi). Bằng cách (3) của gen mã hoá protein lông của các tác nhân gây bệnh Lyme (Borrelia burgdorferi). Bằng cách đó, bệnh Lyme có thể được chẩn đoán sớm và chính xác.

đó, bệnh Lyme có thể được chẩn đoán sớm và chính xác.

 . Các tác nhân gây bệnh đường sinh dục: Tác nhân gây bệnh lậu và các viêm niệu đạo sau lậu để . Các tác nhân gây bệnh đường sinh dục: Tác nhân gây bệnh lậu và các viêm niệu đạo sau lậu để khó nuôi cấy.

khó nuôi cấy.

 Neisseria gonorrhoeae (4) và các tác nhân thường gây viêm niệu đạo sau lậu (Chlamydia Neisseria gonorrhoeae (4) và các tác nhân thường gây viêm niệu đạo sau lậu (Chlamydia

trachomatis, Ureaplasma urealyticum và Mycoplasma genitalium) đã có thể đồng thời tìm được trachomatis, Ureaplasma urealyticum và Mycoplasma genitalium) đã có thể đồng thời tìm được trong một ống PCR duy nhất với bệnh phẩm là nước tiểu (5). Điều này không những mang lại lợi trong một ống PCR duy nhất với bệnh phẩm là nước tiểu (5). Điều này không những mang lại lợi ích thiết thực cho bệnh nhân mà còn góp phần đắc lực cho nghiên cứu, tìm hiểu, đánh giá tình hình ích thiết thực cho bệnh nhân mà còn góp phần đắc lực cho nghiên cứu, tìm hiểu, đánh giá tình hình bệnh một cách sát thực hơn, do trước đây không có điều kiện nuôi cấy tìm c n nguyên gây bệnh.ǎ bệnh một cách sát thực hơn, do trước đây không có điều kiện nuôi cấy tìm c n nguyên gây bệnh.ǎ

 . Vi khuẩn lao:. Vi khuẩn lao:

 Mycobacterium tuberculosis không phải là quá khó nuôi cấy; tuy vậy, chúng mọc rất chậm (thời Mycobacterium tuberculosis không phải là quá khó nuôi cấy; tuy vậy, chúng mọc rất chậm (thời gian nhân đôi từ 14 - 15 giờ, so với E. coli, khoảng 20 phút). Khoảng 2 tháng sau khi nuôi cấy mới gian nhân đôi từ 14 - 15 giờ, so với E. coli, khoảng 20 phút). Khoảng 2 tháng sau khi nuôi cấy mới nhìn thấy khuẩn lạc lao. Vì vậy, giá trị phục vụ lâm sàng của phương pháp nuôi cấy bị hạn chế rất nhìn thấy khuẩn lạc lao. Vì vậy, giá trị phục vụ lâm sàng của phương pháp nuôi cấy bị hạn chế rất nhiều. Phương pháp nhuộm soi từ bệnh phẩm thì có độ nhạy rất kém (phải có trên 105 vi khuẩn/ml nhiều. Phương pháp nhuộm soi từ bệnh phẩm thì có độ nhạy rất kém (phải có trên 105 vi khuẩn/ml đờm mới cho kết quả dương tính).

đờm mới cho kết quả dương tính).

 PCR đã góp phần đắc lực giải quyết việc này. Nó có thể cho kết quả trong vòng 1 - 2 ngày với độ PCR đã góp phần đắc lực giải quyết việc này. Nó có thể cho kết quả trong vòng 1 - 2 ngày với độ nhạy gấp khoảng 10.000 lần so với các phương pháp cổ điển. Vì vậy, có thể chứng minh được sự có nhạy gấp khoảng 10.000 lần so với các phương pháp cổ điển. Vì vậy, có thể chứng minh được sự có mặt của vi khuẩn lao trong dịch não tuỷ, nước tiểu và các loại bệnh phẩm chứa ít vi khuẩn mà mặt của vi khuẩn lao trong dịch não tuỷ, nước tiểu và các loại bệnh phẩm chứa ít vi khuẩn mà trước đây chẩn đoán rất khó kh n.ǎ

trước đây chẩn đoán rất khó kh n.ǎ

 Dùng PCR để tìm đoạn gen mã hoá cho một protein 30.000 Dùng PCR để tìm đoạn gen mã hoá cho một protein 30.000 Mdal liên quan tới độc tính của Entamoeba histolytica,

Mdal liên quan tới độc tính của Entamoeba histolytica, người ta có thể phân biệt được amíp gây bệnh và amíp người ta có thể phân biệt được amíp gây bệnh và amíp

không gây bệnh (6).

 . Vi rút:. Vi rút:

 Vi rút viêm gan B (7,8), HIV, vi rút thuỷ đậu, vi rút Herpes Vi rút viêm gan B (7,8), HIV, vi rút thuỷ đậu, vi rút Herpes simplex, Papillomavirus, Cytomegavirus và Enterovirus đã simplex, Papillomavirus, Cytomegavirus và Enterovirus đã

được chẩn đoán thành công bằng PCR.

 Đối với HIV, những tài liệu đã dẫn cho thấy, PCR cho kết Đối với HIV, những tài liệu đã dẫn cho thấy, PCR cho kết quả dương tính sớm hơn các dấu hiệu biến đổi về miễn dịch quả dương tính sớm hơn các dấu hiệu biến đổi về miễn dịch từ 3 - 6 tháng; đặc biệt là nó cho phép chẩn đoán HIV ở trẻ từ 3 - 6 tháng; đặc biệt là nó cho phép chẩn đoán HIV ở trẻ

sơ sinh, khi mà các kháng thể kháng HIV ở trẻ lúc này, có sơ sinh, khi mà các kháng thể kháng HIV ở trẻ lúc này, có

thể, chỉ đơn thuần là do từ mẹ truyền sang.

 Nói tóm lại, dùng PCR để tìm tác nhân gây bệnh đã được áp dụng Nói tóm lại, dùng PCR để tìm tác nhân gây bệnh đã được áp dụng rất rộng rãi. PCR có lợi thế lớn là nhanh (thời gian cần thiết cho rất rộng rãi. PCR có lợi thế lớn là nhanh (thời gian cần thiết cho

chẩn đoán tính bằng "giờ" so với các kỹ thuật kinh điển phải tính chẩn đoán tính bằng "giờ" so với các kỹ thuật kinh điển phải tính bằng "ngày"), nhạy (độ nhạy rất cao, chỉ cần từ 10 - 1000 tế bào bằng "ngày"), nhạy (độ nhạy rất cao, chỉ cần từ 10 - 1000 tế bào

vi khuẩn, tuỳ theo kỹ thuật, là đủ) và độ đặc hiệu cũng rất cao.

Nhờ vậy, bệnh được chẩn đoán nhanh hơn và chính xác hơn.

 Giá trị chẩn đoán bệnh của PCR đặc biệt trong những trường hợp Giá trị chẩn đoán bệnh của PCR đặc biệt trong những trường hợp vi sinh vật không nuôi cấy được hoặc nuôi cấy rất khó kh n, tốn ǎ vi sinh vật không nuôi cấy được hoặc nuôi cấy rất khó kh n, tốn ǎ kém; hoặc kết quả nuôi cấy rất chậm, hoặc ở những bệnh nhân kém; hoặc kết quả nuôi cấy rất chậm, hoặc ở những bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi vào viện, vì rằng PCR không nhất đã dùng kháng sinh trước khi vào viện, vì rằng PCR không nhất

thiết đòi hỏi phải có vi sinh vật sống.

 Tuy vậy,cho đến nay, do những điểm hạn chế của nó (như đòi hỏi Tuy vậy,cho đến nay, do những điểm hạn chế của nó (như đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên vật liệu riêng, đắt tiền; cán bộ kỹ phải có trang thiết bị và nguyên vật liệu riêng, đắt tiền; cán bộ kỹ

thuật phải có trình độ nhất định; kỹ thuật thực hiện còn phức thuật phải có trình độ nhất định; kỹ thuật thực hiện còn phức

tạp), PCR chỉ bổ sung chứ không thay thế hẳn được phương pháp tạp), PCR chỉ bổ sung chứ không thay thế hẳn được phương pháp

chẩn đoán kinh điển khác chẩn đoán kinh điển khác

Ba giai đoạn phản ứng PCR thực hiện trên máy luân nhiệt (Thermalcycles)