2.3.1 Phương pháp định tính sơ bộ thành phần hóa học
Xay nhuyễn mẫu nguyên liệu, ngâm chiết bằng các dung môi thích hợp, lọc lấy dịch chiết.
Dùng các thuốc thử đặc trưng để phát hiện sự có mặt của các nhóm chức (tạo màu, kết tủa, tạo bọt…).
2.3.2 Phương pháp chiết suất, cô lập các hợp chất 2.3.2.1 Phương pháp chiết suất[6]
Chiết là phương pháp dùng dung môi (một hay hỗn hợp) để tách lấy một hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.
Các phương pháp chiết bao gồm chiết rắn - lỏng, chiết lỏng – lỏng (thường kết hợp cả hai phương pháp).
Trong các phương pháp trên có thể kết hợp với đun nóng (chiết nhiệt độ cao), chiết tuần hoàn (sử dụng hệ thống Soxhlet) tùy theo nhu cầu cần lấy những hợp chất kém bền với nhiệt hay không.
Phương pháp chiết rắn – lỏng sử dụng trong đề tài này là phương pháp chiết tuần hoàn (sử dụng hệ thống Soxhlet). Kỹ thuật này không đòi hỏi thiết bị phức tạp, không tốn nhiều dung môi và phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
2.3.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất[6]
Các phương pháp chung được áp dụng để phân lập các hợp chất chủ yếu là phương pháp sắc ký bao gồm sắc ký cột thường với chất hấp thu là silica gel pha thường, cũng như các loại silica gel pha đảo, kết hợp với sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Sắc ký cột
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp thu là pha tĩnh bao gồm các loại silica gel (kích cỡ hạt khác nhau) pha thường cũng như pha đảo YMC, ODS, Dianion,…. Chất hấp thu được nhồi vào cột (có thể là cột thủy tinh hay cột bằng kim loại inox, nhưng thường sử dụng là cột bằng thủy tinh). Kích cỡ hạt của chất hấp thu là yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng đến khả năng tách của chất hấp thu. Kích cỡ hạt càng nhỏ thì khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp thu có độ hạt càng nhỏ thì tốc độ giải ly càng giảm. Trong một số trường hợp, khi lực trọng trường
15
không đủ lớn thì gây nên hiện tượng tắt cột (dung môi không chảy xuống được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất (áp suất trung bình - MPC, áp suất cao - HPLC).
Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính cột (d) so với chiều cao cột (l) cũng rất quan trọng và thể hiện khả năng tách tốt của cột. Trong sắc ký, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi được của dung môi gọi là Rf . Chính nhờ sự khác nhau về Rf mà người ta tách được từng chất ra khỏi hỗn hợp.
Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp thu cũng rất quan trọng và còn tùy thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (dao động từ 1/5 đến 1/10), còn nếu tách tinh thì yêu cầu tỉ lệ này cao hơn và tùy vào hệ số tách (tức thì tùy thuộc vào sự khác nhau về Rf của các chất) mà hệ số này dao động trong khoảng 1/20 đến 1/30.
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể tiến hành đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì người ta tẩm chất vào silica gel. Nếu tách tinh, người ta đưa trực tiếp lên cột bằng cách hòa tan bằng dung môi giải ly cột với một lượng tối thiểu.
Việc chuẩn bị cột ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả tách. Yêu cầu cột không được có bọt khí bên trong, cột không được nứt, gãy.
Tốc độ dòng chảy của dung môi giải ly cột cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách.
Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Tuy nhiên, tốc độ dòng chảy không nên quá nhanh cũng không nên quá chậm.
Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột. SKLM được tiến hành một miếng bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay thủy tinh. Ngoài việc sử dụng SKLM định hướng cho sắc ký cột, người ta còn dùng SKLM để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được trán silica gel dầy hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng nhiều cách khác nhau.
2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc[5]
Phương pháp chung để xác định cấu trúc của các hợp chất là sử dụng các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:
Phổ khối lượng (Mass Spectrocopy)
Phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân mảnh ion
16
của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các peak ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hóa học các hợp chất. Hiện nay có nhiều loại phổ khối lượng. Ví dụ:
+ Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectrocopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV.
+ Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectrocopy), cho pháp xác định peak ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao. Kết quả phổ khối lượng phân giải cao cùng với kết quả phân tích nguyên tố sẽ cho phép khẳng định chính xác công thức của hợp chất hữu cơ.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (Nuclear Magnetic Resonanece Spectrocopy, 1D-NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay dùng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng. Với việc sử dụng các phương pháp phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ carbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân với nhau (spin coupling).
+ Phổ 1H-NMR
Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0 - 14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử. Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau và vì vậy chúng được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học cũng như tương tác spin coupling mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất.
+ Phổ 13C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch của carbon. Mỗi nguyên tử carbon sẽ cộng hưởng ở một môi trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Trong thang đo cho phổ 13C- NRM cũng được tính bằng ppm và với dãy thang đo rộng hơn so với phổ proton (0 – 240 ppm).
17
+ Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
Phổ này cho những tín hiệu phân loại các loại carbon khác nhau. Trên các phổ DEPT, tín hiệu của carbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu phổ của CH và CH3 nằm trên cùng một phía và của CH2 về một phía của phổ DEPT 135. Còn trên phổ DEPT 90 thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (Nuclear Magnetic Resonnanece spectroscopy, 2D-NMR)
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ các phân tử trong không gian hai chiều. Ví dụ:
+ Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)
Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ phổ này. Trên phổ, một trục là là phổ 1H-NMR còn trục kia là 13C-NMR.
+ Phổ 13HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)
Đây là phổ biểu diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.