2.4 QUI TRÌNH THỰC NGHIỆM
2.4.1 Định tính sơ bộ thành phần hóa học của hạt trái đủng đỉnh trên cao methanol
2.4.1.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alcaloid[6][21]
Alcaloid là nhóm hợp chất tự nhiên hiện diện khá nhiều trong các họ thực vật với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Một loài thực vật được xem là có alcaloid phải chứa ít nhất 0,05% alcaloid so với mẫu cây khô. Các alcaloid được chia thành ba loại: alcaloid thật, protoalcaloid và giả-alcaloid (Pseudoalcaloid).
Có nhiều thuốc thử dùng để định tính alcaloid nhưng trong đó ba thuốc thử thông dụng được sử dụng là Dragendorff, Wagner và Mayer.
Thuốc thử Dragendorff
- Hòa tan 8,0 g Nitrat bismuth Bi(NO3)3.H2O trong 25 ml HNO3 30%.
- Hòa tan 28 g KI và 1ml HCl 6N trong 5 ml nước.
- Hỗn hợp hai dung dịch để yên trong tủ lạnh 5ºC cho tủa màu sậm và tan trở lại, lọc và thêm nước cất cho đủ 100 ml. Dung dịch có màu cam đỏ.
18
- Cho 2 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm, rồi nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và quan sát hiện tượng, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện kết tủa cam - nâu.
Thuốc thử Wager
- Hòa tan 1,27 g I2 và 2 g KI trong 20 ml nước cất. Thêm nước cho đủ 100 ml.
- Cho 2ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm, rồi nhỏ vài giọt thuốc thử Wager và quan sát hiện tượng, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu nâu.
Thuốc thử Mayer
- Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất.
- Hòa tan 5 g KI trong 10 ml nước cất.
- Thêm nước vào hỗn hợp hai dung dịch cho đủ 100 ml.
- Cho 2 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm, rồi nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer và quan sát hiện tượng, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
2.4.1.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid[6][21]
Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, hoa, quả…. Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong dược liệu nguồn gốc thực vật. Phần lớn các flavonoid có màu vàng (do từ flavus có nghĩa là màu vàng). Tuy nhiên, một số sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học chúng có cùng khung sườn căn bản.
Để định tính flavonoid có thể dùng các phản ứng như Shibata, dung dịch Pb(CH3COO)2 bão hòa, H2SO4 đặc và dung dịch FeCl3 1%.
Phản ứng Shibata
- Cho 2 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm sau đó cho thêm 1 ml ancol tert- butyl, 0,5 ml HCl đậm đặc và 3 - 5 hạt Mg kim loại. Đun nhẹ trong vài phút, quan sát hiện tượng.
- Nếu dung dịch mẫu có chứa flavon, flavanon, flavonol, flavanonol, xanthon trong dung dịch sẽ có màu cam, đỏ hoặc tím. Nếu dung dịch mẫu có chứa isoflavon, isoflavanon, auron dung dịch không đổi màu.
Phản ứng với dung dịch chì acetat bão hòa
- Lấy 2 ml dung dịch mẫu, nhỏ vài giọt dung dịch Pb(CH3COO)2, quan sát hiện tượng.
- Nếu có flavonoid thì dung dịch xuất hiện kết tủa vàng.
19
Phản ứng với H2SO4 đặc
- Lấy 2 ml dung dịch mẫu, nhỏ từng giọt H2SO4 đặc và quan sát hiện tượng.
- Nếu dung dịch mẫu thử có chứa flavon và flavonol thì dung dịch có màu vàng đậm đến màu cam. Chalcon, auron cho màu đỏ hoặc xanh dương - đỏ, flavanon cho màu từ cam đến đỏ.
Phản ứng với dung dịch FeCl3 1%
- Lấy 2 ml dung dịch mẫu, cho tiếp vào ống nghiệm 1 ml dung dịch FeCl3 1 %, quan sát hiện tượng.
- Nếu dung dịch mẫu có chứa flavonoid và tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng vị trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu.
2.4.1.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất steroid[6][21]
Steroid là nhóm hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi trong giới động vật và thực vật, với cấu trúc tổng quát là hệ thống vòng cyclopentanoperhydrophenantren hoặc trong một vài trường hợp hiếm gặp là dạng biến đổi của hệ thống vòng nói trên.
Để định tính sự có mặt của steroid có thể dùng các phản ứng như Liebermann- Burchar, Salkowski.
Phản ứng Liebermann-Burchar
- Anhidrid acetic (1 ml), chloroform (1 ml) làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Cho dung dịch mẫu pha trong chloroform. Quan sát hiện tượng.
- Phản ứng dương tính là dung dịch đổi màu thành xanh dương, lục, cam hoặc đỏ.
Phản ứng Salkowski
- Hòa tan mẫu thử trong chloroform, sau đó nhỏ thêm H2SO4 (1 ml). Quan sát hiện tượng.
- Phản ứng dương tính là dung dịch chuyển sang màu đỏ đậm, xanh, xanh-tím.
2.4.1.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycosid[6][21]
Các glycosid hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận cây như lá, vỏ, hạt,…. Các glycosid thường là chất kết tinh và có vị đắng. Glycosid là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm hai phần: phần đường và phần không đường thường được gọi là aglycon.
20
Để định tính sự có mặt của của hợp chất glycosid có thể dùng các thuốc thử như Fehling, Tollen.
Thuốc thử Fehling
- Hòa tan 63,9 g CuSO4.5H2O tinh khiết trong nước. Acid hóa nhẹ dung dịch thu được bằng dung dịch H2SO4 loãng. Thêm nước cất đến 1 lít. Dung dịch có màu xanh da trời.
- Hòa tan 346 g tartrate kép kali natri (muối Seignette) và 120 g NaOH trong nước sau đó thêm nước cất đến thể tích 1 lít. Dung dịch này không màu.
- Trộn 2 dung dịch theo tỉ lệ 1:1 ngay trước khi sử dụng. Khi bảo quản lâu phải để riêng 2 dung dịch.
- Lấy 2 ml dung dịch mẫu, sau đó cho thêm 1 ml thuốc thử Fehling. Quan sát hiện tượng.
- Phản ứng dương tính nếu có xuất hiện kết tủa Cu2O màu đỏ gạch.
Thuốc thử Tollens
- Lấy 1 ml dung dịch AgNO3 5% và nhỏ từng giọt NH3 đặc để tạo thành kết tủa.
Sau đó thêm từ từ NH3 vào cho đến khi kết tủa tan hoàn toàn (không cho thừa NH3).
- Lấy 2 ml dung dịch mẫu cho vào thuốc thử, đun sôi. Quan sát hiện tượng.
- Phản ứng dương tính nếu có xuất hiện kim loại bạc bám vào thành ống nghiệm.
2.4.1.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin[6][21]
Saponin còn gọi là saponosid do chữ Latin sapo có nghĩa là xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng), là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Tạo bọt là một đặc trưng của saponin, nên đây là một trong những phương pháp chính xác định sự hiện diện của saponin.
Xác định bằng cách tạo bọt
- Lấy vài gam bột, lắc mạnh với 5 – 10 ml nước, dấu hiệu đầu tiên là xuất hiện bọt bền vững.
Xác định sơ bộ hiện diện của saponin steroid và saponin triterpen
- Lấy khoảng 0,5 g bột, thêm khoảng 5 ml nước cất. Hỗn hợp được đun sôi trong ống nghiệm trên bếp cách thủy, làm lạnh và lọc lấy nước.
21
- Lấy 2 ống nghiệm, ống 1 thêm 5 ml dung dịch HCl 0,1 N, ống hai thêm vào 5 ml dung dịch NaOH 0,1 N. Thêm vào cả hai ống nghiệm 2 - 3 giọt dung dịch mẫu và lắc thật mạnh trong khoảng 1 phút.
- Nếu như trong cả hai ống nghiệm, bọt được tạo thành bằng nhau cả về kích thước, số lượng và sự bền vững của cột bọt thì nguyên liệu có chứa saponin triterpen.
Nếu như ở ống nghiệm chứa NaOH, bọt nhiều hơn một vài lần hay sự bền vững thì nguyên liệu có chứa saponin steroid.
2.4.1.6 Khảo sát sự hiện hiện của các hợp chất tanin[6][21]
Tanin là nhóm hợp chất polyphenol phân bố rộng rãi trong họ thực vật. Người ta gặp tanin hằng ngày trong cuộc sống (trà, rượu vang đỏ, nhiều loại trái cây nhất là trong trái măng cụt,…). Tanin được phân thành hai nhóm chính là tanin thủy giải được và tanin hóa đặc.
Để định tính sự có mặt của tanin có thể dùng các thuốc thử như Stiasny, dung dịch FeCl3 1% và dung dịch Pb(CH3COO)2 bão hòa.
Thuốc thử Stiasny
- Formol 36% (20 ml), HCl đậm đặc (10 ml)
- Lấy 2 ml dung dịch mẫu, sau đó thêm 1 ml thuốc thử Stiasny, quan sát hiện tượng.
- Phản ứng dương tính có tanin khi xuất hiện trầm hiện màu đỏ.
Thuốc thử FeCl3
- Lấy 2 ml dung dịch mẫu, cho tiếp vào ống nghiệm 1 ml dung dịch FeCl3, quan sát hiện tượng.
- Nếu dung dịch chuyển thành màu xanh đen hoặc lục đen là dấu hiệu dương tính có tanin.
Thuốc thử Pb(CH3COO)2
- Lấy 2 ml dung dịch mẫu, cho tiếp vào ống nghiệm 1 ml dung dịch Pb(CH3COO)2, quan sát hiện tượng.
- Phản ứng dương tính có tanin khi xuất hiện kết tủa màu vàng 2.4.1.7 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất coumarine[6][21]
Coumarine là nhóm hợp chất phenol phân bố rộng rãi trong họ thực vật. Nó là những dẫn chất -pyron có cấu trúc C6 - C3. Người ta chia coumarine thành ba nhóm chính là coumarine đơn giản, Furanocoumarin và Pyranocoumarin.
22
Để định tính sự có mặt của coumarine có thể dùng các phản ứng như mở vòng lacton và diazo hóa.
Phản ứng mở vòng lacton
- Cho vào hai ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dung dịch thử, thêm vào một trong hai ống 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống nghiệm trên bếp cách thủy đến sôi, lấy ra để nguội, thêm vào mỗi ống 4 ml nước cất. Nếu chất lỏng trong ống có kiềm trong hơn ống không kiềm có thể xem là dương tính. Tiếp tục đem acid hóa ống có kiềm với vì giọt HCl đặc, nếu dung dịch đang trong suốt lại xuất hiện vẩn đục hoặc kết tủa thì đó là dấu hiệu dương tính.
Phản ứng diazo hóa
- Thuốc thử diazo: Hòa tan nóng 0,9 g acid sulfanilic trong 9 ml acid hydroclorid đặc. Pha loãng với nước vừa đủ 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch này ngâm trong nước đá. Thêm vào đó 10 ml dung dịch natri nitrit 4% vừa được làm lạnh bằng cách ngâm trong nước đá. Giữ hỗn hợp ở 0ºC trong 15 phút.
- Cho vào ống nghiệm 2 ml dung dịch mẫu, thêm 3 ml dung dịch Na2CO3 2%.
Đun cách thủy đến sôi và để nguội, cho vài giọt thuốc thử diazo. Quan sát hiện tượng.
- Nếu dung dịch trong ống chuyển sang màu đỏ thẫm là dương tính.