Muốn có một kết quả tách tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu. Các điều kiện đó bao gồm:
1.4291. Lựa chon pha tinh
Dựa vào các tài liệu Dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích ... ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thuận, cột pha đảo hay các loại cột khác nhau. Chúng ta thông thường dùng 2 loại cột pha thuận (NP) và cột pha đảo (RP). Ngoài ra, ta có thể dùng một
số loại cột khác như cột CN, cột NH¿...
a. Cột pha thuận (NP): Silicagel trung tính
Pha tĩnh: Cột này là loại cột dùng đề tách các chất không phân cực hay ít phân cực. Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước.
Pha động: dùng cho lọai này là các dung môi không phân cực hay ít phân cực như: Methanol, Benzen, Acetonitril, Chlorofoc...
b.Cột pha dao (RP): ( Silicagel da Alkyl hoa)
Dung dé tach cdc chat không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực
có thể tạo cặp ion. Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là
thay thế nguyên tử H bằng các mạch cacbon thắng (C8 hay C18 tương đương RP 8 hay RP 18) hay các mạch cacbon vòng (Phenyl- tương đương cột Phenyl) vi thé nó ít phân cực hay phân cực rất ít
Pha Động:
Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực như:
Methanol, Acetomitril, nước hay các loại dung dịch đệm. hỗn hợp của các dung môi đệm.
Sự tách của chất được nhôi loại cột này có độ lặp lại cao và nó được ứng dụng chủ yếu trong phân tích được phâm. Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu.
Hiện nay pha tĩnh trên nền Silicagel đã có hàng trăm chất khác nhau tùy thuộc vào nhóm thế của nguyên tử H, ngoài ra còn có các lọai pha tĩnh
A À : A A À Á % A + A À
trên nên oxit nhôm, trên nên chât hữu cơ cao phân tử, trên nên mạch cacbon...
1.4292 Lựa chọn pha động
Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có
trong mẫu phân tích, ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của Peak đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động
của thiết bị.
- Pha dong cé thé làm thay đồi - Déchon loc
- Thoi gian luu
- Hiéu nang tach của cột - D6 phan giai
- Tinh déi xứng của Peak
Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn, được pha động có thành
phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các
chất cần phân tích. Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau:
Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có. Không được làm cho pha tĩnh bị biến đối hóa học.
Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng (đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm kết tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột Ví dụ: đệm photphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trén column).
Pha động phải bền vững theo thời gian càng bên lâu càng tốt nhưng ít nhất chúng là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu.
Phải có độ tinh khiết cao, hoá chất tĩnh khiết phân tích.
Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
Phải phù hợp voi loai Detector. Vi du: UV - VIS khi st dung thi dung môi không được hấp thụ quang (Ví dụ: acid acetic ở bước sáng thấp < 220 nm). Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang.
Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt.
Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC) pha động là dung môi phân cực là: Nước, ACN, MeOH, acid hay Base hữu cơ và một vài Amin hay Aminoacid...
Do sự thêm nước vào dung môi hữu cơ tạo thành một pha động phân cực hơn chất hữu cơ nguyên một mình nó. Ví dụ: thêm nước vào ACN hay MeOH... Sẽ tạo được pha động phân cực hơn nó. Tất nhiên, độ phân cực phụ thuộc vào tỷ lệ nước được thêm vào.
Ngoài các dung môi chính, trong thành phần pha động trong rất nhiều trường hợp tách RP-HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm pH để ôn định pH. Chất tạo phức, tạo cặp 1on để tạo ra sự rửa giải tốt nhất.
Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây dựng chương trình sắc ký. Chỉ khi lựa chọn điều kiên sắc ký tốt, phù hợp thì chúng ta mới có thê định tính, định lượng được các lọai thuốc đa thành phần một cách nhanh chóng và hiệu quả cao.