1.4.3.1. Chudn bi dung cu va may moc
May HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ dé bao đảm máy họat động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung
môi, tốc độ dòng, năng lượng đèn... đúng theo yêu cầu thông số của máy đo nhà sản xuất đặt ra.
Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách, và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký:
Vi dụ: Với sắc ký pha thuận NP-HPLC: rửa bằng MeOH, không rửa
bằng nước
Với sắc ký pha đảo RP-HPLC: Khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa nước trước cho sạch muối, sau đó rửa. Tỷ lệ ACN hay MeOH: Nước (50: 50) cho sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị mốc khi đề lâu. Tuyệt đối tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đó đề cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thé dùng được. Lưu ý nếu rửa cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng được các yêu cầu phân tích.
1.4.3.2. Chuẩn bị dung môi pha động:
Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết dùng cho HPLC.
Các hóa chất dùng phải là loại tinh khiết phân tích.
Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu, để ồn định dung môi đúng thời gian.
Mẫu thử: Xử lý mẫu thử theo đúng qui trình, theo nguyên tắc:
Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động. trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu.
Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hay chiết...
Phải lọc và ly tâm. lọc mẫu qua màng loc 0,45 pum.
Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột, có thê gây ra nghẽn cột.
Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thứ là tốt nhất, ngoài ra có thê dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phan.
1.4.3.3. Cach do HPLC
Mỗi máy có mỗi cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm sắc ký. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau:
Chạy máy với dung môi pha động đề đuôi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột.
Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như:
+ Cấu hình máy.
+ Tỷ lệ các dung môi pha động.
+ Bước sóng, thành phần mẫu. các thông số của quá trình phân tích yêu cầu.
1.5. Định lượng bằng phương pháp(HPLC)
Quá trình định lượng bằng phương pháp HPLC có thể chia làm 4 bước. Mỗi bước đều có ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả định lượng
1.5.1. Các bước định lượng bằng phương pháp HPLC - Lấy mẫu thử.
- Tiến hành đo sắc ký.
- Đo tín hiệu detector.
- Phương pháp định lượng.
1.5.1.1 Lấy mẫu thử
Sai số do lấy mẫu có thể tăng lên ở ít nhất 3 khâu: Lấy mẫu đại diện, bảo quản mẫu và xử lý mẫu.
Đề giảm sai số, việc lấy mẫu phải tôn trọng triệt để theo các nguyên tắc
đã được quy định đối với từng loại đối tượng mẫu đề có thể lấy được đại diện.
Quá trình bảo quản mẫu cũng có thể dẫn đến sai số đối với mẫu thử là chất bay hơi, chất có thể phản ứng được với hơi nước hoặc không khí.
Các thành phần vi lượng có thể bị hấp phụ hoặc phản hấp phụ bởi bình chứa trong thời gian bảo quản.
Độ nhạy cao hơn để có thể đo được bằng detector của máy. Cách này được áp dụng đối với những chất có đáp ứng rất nhỏ hoặc hoàn toàn không có đáp ứng với detector đo độ hấp thụ quang học.