PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy các chủng vi sinh vật a. Phương pháp nuôi chủng xạ khuẩn sinh axit
Chủng S. clavuligerusđược nuôi cấy ở 2 môi trường giàu khoáng và NDYE.
Môi trường NDYE sử dụng cho nuôi dạng đặc dùng để bảo quản và giữ giống.
Còn môi trườngchuẩn đều được nuôi cấy dạng đặc và lỏng , môi trường chuẩn là môi trường để xạ khuẩn sinh trưởng, phát triển và tạo axit
+ Nuôi cấy trên môi trường NDYE đặc:
Bước 1: Chuẩn bị môi trường
- Tiến hành cân các loại hóa chất có trong thành phần môi trường tùy thuộc lượng môi trường cần từ đó có tỉ lệ các chất. Sau đó, bổ sung thêm nước cất theo tỉ lệ cần thiết.
- Hấp khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút.
STT Thành phần Khối lượng
1 Maltozơ 22 g/l
2 Cao nấm men 5 g/l
3 NaNO3: 4,28 g/l
4 K2HPO4: 0,23 g/l
5 HEPES: 4,77 g/l
6 MgSO4.7H2O: 0,12 g/l
7 NaOH 1N 10 ml
Trace elements solution:
ZnCl2:
FeCl2.6 H2O:
CuCl2.2H2O:
MnCl2.4H2O:
Na2B4O7.10 H2O:
(NH4)6MO7O24.4 H2O:
2 ml 0,0008 g 0,004 g 0,0002 g 0,0002 g 0,0002 g 0,0002 g
- Sau đó lấy môi trường ra để nguội trong tủ cấy đã khử trùng bằng cồn và tia UV, khi nhiệt độ còn khoảng 40oC thì tiến hành đổ môi trường.
- Bổ sung thêm khoáng chất thích hợp vào môi trường.
- Đổ môi trường vào các đĩa petri, mỗi đĩa khoảng 15-20 ml môi trường, láng đều môi trường ra đĩa và để nguội nước bốc hơi hết khô mặt đĩa, chuẩn bị xong môi trường có thể cấy hoặc bảo quản ở 4oC.
Bước 2: Tiến hành nuôi cấy
Chủng giống bảo quản trước đó được để giã đông, sau đó dùng micropipet lấy khoảng 600àl mẫu nhỏ vào đĩa mụi trường. Dựng que trang đó khử trựng trang đều xạ khuẩn ra đĩa sau đó đem nuôi cấy ở tủ ấm trong 3 ÷ 5 ngày ở 28 ÷ 30 oC.
+ Nuôi cấy trong môi trường giàu khoáng dạng lỏng:
Bước 1: Chuẩn bị môi trường và các dụng cụ để nuôi lỏng.
- Tiến hành cân các loại hóa chất có trong thành phần môi trường tùy thuộc lượng môi trường cần sử dụng từ đó có tỉ lệ các chất. Sau đó, bổ sung thêm nước cất theo tỉ lệ cần thiết. Ngoài ra cần chuẩn bị bình tam giác và các dụng cụ khác để nuôi lỏng. Bình sau đó được đậy gạc và bọc giấy bạc.
- Hấp khử trùng môi trường, khoángchất và các dụng cụ ở 121oC trong 15 phút.
- Sau đó lấy môi trường ra để nguội và bổ sung khoáng chất trong tủ cấy đã khử trùng bằng cồn và tia UV.
Bước 2: Tiến hành nuôi cấy
- Dùng thìa đã được hấp khử trùng xúc lấy một phần 1,5 ÷ 2cm2 đĩa peptri chứa xạ khuẩn đã được nuôi cấy trong NDYE đặc, đậy lại bằng gạc và giấy bạc đã khử trùng trước đó.
- Đem nuôi lắc ở 28 oC trong 3 ÷ 5 ngày để thu lấy axit , tùy thuộc lượng vào tỉ lệ tiếp giống và môi trường nuôi cấy.
+ Nuôi cấy trong môi trường giàu khoáng dạng rắn: Ta tiến hành chuẩn bị môi trường có thành phần tương tự như đối với chuẩn dạng lỏng,có bổ sung thêm 1,5% ÷ 2% agar và thực hiện nuôi cấy trên đĩa như đối với môi trường NDYE đặc.
b. Phương pháp nuôi các chủng VSV kiểm định.
Để nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên ta tiến hành nuôi cấy trên môi trường LB đặc.
Bước 1: Chuẩn bị môi trường.
- Tiến hành cân các loại hóa chất có trong thành phần môi trường tùy thuộc lượng môi trường ta cần mà có tỉ lệ các chất, sau đó bổ sung thêm nước cất theo thể tích ta cần.
- Hấp khử trùng môi trường ở 1210C trong 20 phút.
- Sau đó lấy môi trường ra để nguội trong tủ cấy đã khử trùng bằng cồn và tia UV, khi nhiệt độ còn khoảng 400C ta tiến hành đổ môi trường.
- Đổ môi trường vào các đĩa petri, mỗi đĩa khoảng 15 ÷ 20 ml môi trường, sau đó láng đều môi trường ra đĩa và để nguội nước bốc hơi hết làm khô mặt đĩa, chuẩn bị xong môi trường ta có thể cấy vi khuẩn hoặc bảo quản ở 40C.
Bước 2:Nuôi cấy
Sau khi chuẩn bị môi trường ta tiến hành nuôi cấy VSV.Lấy ống giống bảo quản từ tủ -200C ra cho gió đụng rồi dựng micropipet lấy khoảng 300àl mẫu nhỏ vào đĩa môi trường, dùng que trang đã khử trùng trang đều ra đĩa, sau đó đem nuôi cấy ở tủ ấm 30 ÷ 370C, nuôi trong 16 ÷ 24 giờ.
2.2.2. Phương pháp bảo quản giống a. Phương pháp bảo quản dạng dịch nuôi
Để bảo quản VSV ta sử dụng glyxerol với nồng độ từ 20 ÷ 30% được hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau khi nuôi cấy VSV ta tiến hành bảo quản giữ giống. Dùng micropipet lấy dịch nuôi VSV cho vào ống eppendorf đã khử trùng tiếp theo ta cho glyxerol đã khử trùng vào và lắc nhẹ nhàng để dịch VSV hòa tan đều trong glyxerol. Tỷ lệ glyxerol và dịch nuôi VSV là 1:1.
b. Phương pháp bảo quản dạng bào tử
Sau khi nuôi cấy các chủng vi khuẩn đã mọc bào tử, chúng ta tiến hành bảo quản giống như sau:
+ Cho 4 ÷ 5ml nước cất đã khử trùng vào đĩa petri có chứa vi khuẩn, dùng thìa cạo nhẹ mặt thạch rồi lấy micropipet hút lấy dịch có chứa bào tử cho vào ống fancol sau đó ly tâm ở nhiệt độ phòng, tốc độ 10000 v/p trong 10 phút.
+ Sau khi ly tâm loại dịch, rửa lại 2 lần bằng nước cất bằng cách lắc đều, cuối cùng ta pha loãng bằng 3ml nước cất đã khử trùng và cho 3ml glyxerol để bảo quản.
2.2.3. Phương pháp gây đột biến xạ khuẩn bằng hóa chất MNNG
Methyl-nitro-nitroso-guanidinm (hay còn có tên gọi khác là: 1-methyl-2- nitro-1-nitrosoguanidin;N-Methyl-N-nitroso-N′-nitroguanidin;N-Methlyl-N′-nitro- N-nitrosoguanidin) được gọi tắt là MNNG hay MNG, NTG(xem hình 2.1) là một hóa chất được sử dụng như một chất gây ung thư và gây đột biến. Nó hoạt độngbằng cách thêm vào nhóm alkyl với O6của guanin và O4 thymin, có thể dẫn đến quá trình chuyển đổi đột biến giữa G-C và A-T.
Trong hóa học hữu cơ, MNNG được sử dụng như một nguồn diazometan khi phản ứng với dung dịch kali hydroxit.MNNG là một chất gây ung thư,[36].
Hình 2.1. Công thức cấu tạo của MNNG,[36]
Chuẩn bị:
- Dịch nuôi xạ khuẩn trong môi trường chuẩn sau khoảng 48 ÷ 72 giờ.
- TM buffer (0,05M Trisbase + 0,05M axit Maleic,chuẩn bằng NaOH để đạt pH 8 hoặc 9).
- 500 ÷ 1000ml NaOH 1N: để trung hòa MNNG thải.
- Nước cất, que chang, ống fancol 15ml đã được khử trùng.
- Đĩa môi trường NDYE đặc, môi trường NDYE lỏng.
- Micropipet.
Tiến hành:
- Lấy khoảng 5 ÷ 7 ml dịch nuôi vào trongống fancol 15ml, tiến hành ly tâm trong điều kiện 6000v/p,40C, 10 phút để loại dịch thu sinh khối tế bào.
- Rửa sinh khối tế bào thu được bằng 2 ÷ 3 ml dung dịch đệm TM buffer (pH
- Cân lần lượt các lượng bột MNNG, đựng trong ống fancol 15ml và hòa tan bằng nước cất vô trùng để đạt được các nồng độ cuối xác định. Bổ sung MNNG vào các ống sinh khối tế bào đã xử lý ở trên tương ứng với từng nồng độ.
- Ủmẫu trong bể ổn nhiệt ở 320C, trong một khoảng thời gian xác định.
- Ly tâm mẫu sau ủ 6000v/p, 10 phút, 40C để loại MNNG, MNNG thải được trung hòa bằng NaOH 1N.
- Rửa sinh khối tế bào bằng 2 ÷ 3 ml TM buffer (pH 8). Sau đó tiến hành ly tâm loại dịch. Ta tiến hành rửa 3 lần như trên.
- Bổ sung 2 ÷ 3 ml môi trường chuẩn lỏng vào các ống sinh khối tế bào sau rửa và nuôi lắc trong 30 phút, 280C.
- Sau đó,ly tâm lạnh cũng trong điều kiện trên để loại bớt dịch,sao cho trong ống cũn khoảng 200 àl dịch thỡ ta bắt đầu tiến hành pha loóng ở cỏc nồng độ 10-1, 10-2 và 10-3 trong nước cất vô trùng tương ứng với mỗi nồng độ MNNG.
- Tại mỗi nồng độ pha loóng, ta lấy 200 àl dịch và chang đều ra cỏc đĩa mụi trường chuẩn đặc, đánh dấu phân loại, nuôi trong tủ ấm 280C và theo dõi 5 ÷ 7 ngày.
Chú ý: Đối với TM buffer pH 9 ta tiến hành làm đột biến tương tự như trên.
a. Phương pháp xác định nồng độ MNNG đến khả năng sinh trưởng và sinh axit Nhóm nghiên cứu tiến hành thử nghiệm xử lý tế bào với các nồng độ MNNG khác nhau từ 0,5 mg/ml đến nồng độ 3mg/ml. Sau khi ủ trong MNNG 30 giờ, tế bào được tách ra khỏi MNNG và nuôi cấy trên đĩa thạch môi trường chuẩn để lựa chọn các tế bào sinh axit. Kết quả thu được xác định bằng phương pháp đo đường kính vòng vô khuẩn với VSV kiểm định.
b. Phương pháp xác định thời gian gây đột biến tại nồng độ MNNG tối ưu đến khả năng axit
Nhóm nghiên cứu tiến hành thử nghiệm xử lý tế bào với các thời gian khác nhau khác nhau từ 15-50 phút. Sau khi ủ trong MNNG 30phút, tế bào được tách ra khỏi MNNG và nuôi cấy trên đĩa thạch môi trường chuẩn để lựa chọn các tế bào sinh axit. Kết quả thu được xác định bằng phương pháp đo đường kính vòng vô khuẩn với VSV kiểm định.
c. Phương pháp xác định pH thích hợp để gây đột biến
Nhóm nghiên cứu tiến hành xử lý tế bào với TM buffer pH8 và pH9,ủ tế bào với nồng độ MNNG 2,5mg/ml trong 30 phút sau đó tế bào được tách ra khỏi MNNG và nuôi cấy trên đĩa thạch môi trường chuẩn để lựa chọn các tế bào sinh axit. Kết quả thu được xác định bằng phương pháp đo đường kính vòng vô khuẩn với VSV kiểm định .
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính axit
Nguyên tắc:Mẫu thử được hòa tan với VSV kiểm định trong môi trường thạch bổ sung thêm CLA , axit sẽ ức chếenzym β-lactamase sinh ra từ VSV kiểm định và tăng hoạt tính kháng sinh.
- Ta tiến hành nuôi lỏng đột biến, ta dùng thìa đã được khử trùng xúc lấy 1,5-2cm2 đĩa peptri chứa xạ khuẩn sau đột biết, đậy lại bằng gạc và giấy bạc đã khử trùng trước đó, đem nuôi lắc ở 28o C trong 3 ngày để thu axit.
- Sau khi nuôi 3 ngày, dịch nuôi cấy cho vào ống fancol 50ml đem đi ly tâm ở 6000v/p trong 10 phút sau đó ly tâm thu dịch.
- Chuẩn bị môi trường cấy VSV kiểm định:
VSV kiểm định được cấy vào môi trường LB lỏng. Nuôi cấy tạo hỗn hợp dịch VSV kiểm định đạt nồng độ 107-108 tb/ml, bằng cách nuôi trong máy lắc 37oC trong 16-24 giờ. tủ cấy Sau đó chuyển sang môi trường LB đặc . Môi trường được hấp khử trùng rồi để nguội trong đã được vô trùng . Khi nhiệt độ môi trường khoảng 40oC phối trộn VSV kiểm định theo tỷ lệ Vgiống / VLB bằng 1% ,sau đó bổ sung thêm dịch nuôi S.clavuligerus đã ly tâm loại tế bào theo tỷ lệ Vgiống / VLB bằng thích hợp. Dùng micropipet lấy dịch nuôi VSV cho vào môi trường LB đặc, lắc đều rồi đổ ra đĩa peptri khoảng 20ml/đĩa.
Sau đó đục giếng thạch nhỏ trên đĩa thạch rắn đã chuẩn bị ở trên.Dùng micropipette lấy khoảng 150àl khỏng sinh Amox vào giếng và nuụi từ 18-24h dưới các điều kiện thích hợp với VSV kiểm định.
2.2.5 Xác định tỷ lệ sống sót
Chủng xạ khuẩn S. clavuligerus được nuôi từ 3-5 ngày trong môi trường khoáng sau khi được xử lý. Sau khi đột biến MNNG ta lấy 1ml tiến hành pha loãng 10-3 và làm một mẫu kiểm chứng là chủng S. clavuligerus tự nhiên cũng lấy 1ml tiến hành pha
Sau khi nuôi cấy 3-5 ngày ở 28oC , xác định số khuẩn lạc phát triển trên các đĩa đột biến và tự nhiên.
Tỷ lệ sống sót (%)= ௧ổ௦ố௨ẩạ௦௨độ௧ế
௧ổ௦ố௨ẩạủ௧ựê
2.2.6 Sàng lọc sau đột biến
Sau 3 ÷ 5 ngày nuôi cấy, trên bề mặt đĩa thạch của chủng xạ khuẩn sau đột biến sẽ xuất hiện các khuẩn lạc có màu xám trắng. Ta chỉ lựa chọn các khuẩn lạc cómàu xám trắng , cấy ria chúng trên bề mặt môi trường chuẩn đặc, sao cho diện tích ria cho mỗi khuẩn lạc 0,5 ÷ 1 cm2, mỗi khuẩn lạc nuôi 1 đĩa thạch và chỉ nuôi từ 3 ÷ 5 khuẩn lạc khác nhau. Tiến hành nuôi cấy trong điều kiện 280C khoảng 72 giờ. Sau đó ta tiến hành nuôi lỏng và thử hoạt tính axit của chủng đột biến để chọn các chủng có khả năng sinh axit hoạt lực mạnh nhất.
2.2.7 Phương pháp tách chiết axit clavulanic thô.
Nguyên tắc:
Axit clavulanic là sản phẩm ngoại bào của chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus.Dựa vào khả năng hòa tan của chất axit trong dung môi hữu cơ như:
n-butanol mà ta tiến hành tách chiết axit clavulanic thô từ dịch nuôi xạ khuẩn.
Cách tiến hành:
- Dịch nuôi cấy xạ khuẩn sau 72-96 giờ được đem ly tâm 6000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút.
- Phần dịch sau ly tâm sẽ được bổ sung n-butanol với tỷ lệ 3:4 về thể tích ở 5oC , chuẩn pH=2 bằng HCl.
- Hỗn hợp dịch nuôi và dung môi được lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ phòng từ 1-2 giờ.
- Axit tan trong n-butanol phân thành 2 phần rõ rệt , dùng phễu chiết thu phần dịch trong n-butanol phía trên. Sau đó, dịch này đem bổ sung nước pH=7 với thể tích tỷ lệ 1:15 , chuẩn pH bằng NaOH 20%.
- Sau đó, dịch này được đem quay cô chân không ở nhiệt… , 126 vòng thu axit thô. Axit thô sau khi qua cô sẽ được hòa tan trong … và bảo quản ở -20oC.
2.2.8 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC). Tiến hành:
Chuẩn bị bình khai triển: bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc nhẹ để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5÷10 mm ở đáy bình. Đậy kín nắp bình và để yên 1 giờ ở nhiệt độ 20 ÷250C. Muốn thu được những kết quả lặp lại, ta chỉ nên dùng những dung môi thật tinh khiết.
Chấm chất phân tích lên bản mỏng: lượng chất được đưa lên bản mỏng có ảnh hưởng rất lớn đến trị số Rf. Lượng chất quá lớn sẽ làm cho vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf gần nhau sẽ bị chồng lấp. Lượng chất quá nhỏ có thể không phát hiện được di độ nhạy của thuốc thử không đủ. Lượng mẫu thông thường cần đưa lên bản mỏng là 0,1 ÷ 50 mg ở dạng dung dịch trong ete, clorofom, nước, hay dung môi thích hợp khác. Thể tích dung dịch từ 0,001 ÷0,005 ml (đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm). Có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng bằng cách chấm nhiều lần ở cùng 1 vị trí và sấy khô sau mỗi lần chấm.
Đường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5 ÷ 2 cm và cách bề mặt dung môi từ 0,8 ÷ 1cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 ÷ 6 mm và cách nhau 15 mm. Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1cm để tránh hiệu ứng bờ.
Triển khai sắc ký: đặt bản mỏng gần như thắng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Đậy kín bình và để yên không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn theo quy định, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi tiến hành hiện vết.
Đánh giá bằng cách quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf và tiến hành định tính, phát hiện tạp chất.