Tài liệu tham khảo
II. Sản xuất các protein nguyên thể
Các protein nguyên thể có thể được sản xuất trong E. coli bằng cách sử dụng promoter điều hòa mạnh và một trình tự liên kết ribosome hiệu quả.
Để biểu hiện gen prokaryote có trình tự liên kết ribosome mạnh chỉ cần cung cấp một promoter là đủ. Trong khi đó, để biểu hiện một gen eukaryote (hoặc một gen prokaryote với một trình tự liên kết ribosome yếu) cần phải cung cấp cả promoter lẫn trình tự liên kết ribosome (Hình 7.4). Các mức độ biểu hiện có thể khác nhau từ dưới 1% cho tới hơn 30% protein hòa tan tổng số (total soluble protein) của tế bào.
Hình 7.4. Protein nguyên thể. Gen tạo dòng (gen A) được đặt sau promoter và trình tự SD của vi khuẩn. mRNA chỉ mã hóa các amino acid đặc hiệu của đoạn chèn để tạo ra loại protein nguyên thể.
Biểu hiện của các gen ở prokaryote: Promoter
Bước đầu tiên khi biểu hiện các protein của eukaryote trong vi khuẩn là chọn một vector biểu hiện mang promoter mạnh (strong promoter)
trình tự DNA h
(còn gọi là vùng 5’ không dịch mã-5’ untranslation region)
t .
E. coli hòa
(toxin) E.
coli
của plasmid.
Phần này giới thiệu các vector biểu hiện mang promoter PL của bacteriophage , promoter (lai) trp-lac và promoter bacteriophage T7.
1. Promoter PL
Promoter PL DNA
Promoter Gen A
mRNA
ATG SD SD
ATG
N C
Protein nguyên thể
Met
của gen c
L
L của như: pPLa 2311, pPLa 8 và pKC30.
Hình 7.5. Vector pKC30. pKC30 là plasmid có kích thước xấp xỉ 6,4 kb, mang promoter PL của bacteriophage và vị trí nhận biết HpaI nằm ở vùng cùng hướng (có 321 nucleotides) với vị trí khởi đầu phiên mã của PL. Plasmid này là dạng phân chia của vector pBR322 và chứa đoạn HindIII-BamHI có nguồn gốc từ bacteriophage được chèn vào giữa các vị trí HindIII và BamHI của vector.
Đoạn chèn cDNA mang tín hiệu promoter (PL), một vị trí được nhận biết bởi sản phẩm của gen N (nutL), bản thân gen N, và tín hiệu kết thúc phiên mã phụ thuộc rho (tL). Vị trí nhận biết HpaI nằm với vùng mã hóa của gen N. Các trình tự DNA được chèn vào trong vị trí HpaI có thể được điều chỉnh bằng cách chuyển plasmid tái tổ hợp vào thể tiềm tan của bacteriophage mẫn cảm với nhiệt độ (cIts857). Các tế bào được sinh trưởng đến giữa pha log ở 30oC và sau đó thay đổi tới 40oC để bất hoạt sản phẩm của gen cI và mở promoter PL. Vector này được dùng để biểu hiện protein cII của bacteriophage với một mức độ khoảng 4% protein hòa tan tổng số của tế bào.
nutL 6000
5000
4000
3000
BamHI 2000
1000 HindIII EcoRI 0
pKC30
(6,4 kb) ori
Amp r
PL PL N
tL
HpaI
2. Promoter trp-lac
E. coli tac (một dạng promoter lai giữa promoter trp và promoter lac) đã được sử dụng thành công để sản xuất một lượng lớn protein trong E. coli (Hình 7.6).
- Promoter trp trp
- -
.
- Promoter lac lac
.
- trp-lac trp- lac-
lac 1982, promoter lai trp-lac
lac (lac repressor).
Hình 7.6. Vector pKK177-3. pKK177-3 là một tac vector chứa các vị trí tạo dòng gen ngoại lai cùng hướng với promoter tac. Cùng hướng với các vị trí tạo dòng là rrnB mang gen 5S của E. coli và hai nhân tố kết thúc phiên mã T1 và T2.
Vùng tạo dòng tac Ptac
5S T1 T2
2000
Ampr
ori
1000
pKK177-3
(2,9 kb)
Vùng tạo dòng EcoRI
Ptac SalI HindIII
SmaI PstI
promoter
3. Promoter bacteriophage T7
Một hệ thống biểu hiện khác đã được phát triển bởi Tabor và Richardson (1985), Studier và Moffatt (1986) đó là hệ thống bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter (Hình 7.7). Hệ thống này được thiết kế cho các biểu hiện có chọn lọc của gen được tạo dòng. Chúng cho phép mức độ biểu hiện cao của một vài gen không được biểu hiện hiệu quả trong các hệ thống khác.
Hình 7.7. Vector pET-3 mang promoter (PФ10) của bacteriophage T7 Ф10 và yếu tố kết thúc phiên mã Ф (TФ). Yếu tố kết thúc phiên mã có thể tạo ra các thể phiên mã có sức đề kháng mạnh hơn đối với hoạt tính exonuclease. Vector pET-3a là dạng phân chia của vector pET-3 trong đó vùng khởi đầu dịch mã (S10) của bacteriophage T7 Ф10 (protein chính của vỏ bacteriophage T7) có mang vị trí BamHI ở codon 11 được đã chèn vào. Vị trí NdeI (CATATG) được đặt ở vùng khởi đầu dịch mã và có thể được sử dụng để xây dựng plasmid biểu hiện các protein nguyên thể.
P 10 S10 T
BglII NdeI NheI BamHI EcoRV NheI EcoRV
ClaI EcoRI 0
1000 4000
PstI
pET-3a
(4,6 kb) ori
3000
2000 Ampr
P 10
Hình 7.8. Vector pAS1. Vector pAS1 là một plasmid dài khoảng 5,8 kb mang promoter PL của bacteriohage và vị trí cắt hạn chế duy nhất BamHI định vị ở codon khởi đầu ATG của gen cII của bacteriophage . Plasmid này có nguồn gốc từ pKC30, trong đó gen cII của bacteriophage được chèn vào ở vị trí HpaI. Gen cII sau đó được cắt bỏ bởi enzyme exonuclease cho tới khi chỉ còn lại codon khởi đầu ATG (G của ATG là nucleotide đầu tiên của vị trí BamHI).
Để biểu hiện gen bị mất codon khởi đầu, pAS1 được cắt bằng BamHI và sau đó xử lý với enzyme mung-bean nuclease hoặc nuclease S1 để loại bỏ đầu lồi (đầu tận cùng sợi đơn). Gắn DNA đầu bằng này với đoạn DNA đầu bằng bắt đầu với codon thứ hai của gen được biểu hiện đặt gen đó trong khung với ATG. Các gen được chèn vào theo kiểu này được điều hòa bằng cách chuyển plasmid tái tổ hợp vào trong thể tiềm tan mẫn cảm nhiệt độ của bacteriophage (cIts857). Các tế bào sinh trưởng tới pha log muộn ở 30oC và sau đó nâng lên 40oC để bất hoạt gen ức chế (repressor) và mở promoter PL. Gen được chèn vào cũng có thể được điều hòa bằng hoạt động của protein N ở nutL và nutR
BamHI 5000
4000
3000
2000 1000
ori
PL
HindIII
Ampr
pAS1
(5,8 kb) EcoRI 0
PL
nuL nuR
tR cII
RBS
cII RBS (ribosome-binding sites: vùng liên kết ribosome)
AAGGAAATACTTACAT ATG GAT CC BamHI cII SD
Met PL cII
:
- 16S rRNA.
-
eukaryote định vị.
- .
1 (Hình 7.8).
Vector pAS1 mang promoter PL và RBS của gen cII của bacteriophage
E. coli thích hợp.
Sàng lọc thể biến nạp để thu các khuẩn lạc có mức độ phiên mã cao.