CHƯƠNG 2 CÔNG NGHỆ HỖ TRỢ SINH SẢN
III. KỸ THUẬT HỖ TRỢ SỰ THỤ TINH
III.1. DẪN TINH NHÂN TẠO (Artificial Insemination_AI)
Dẫn tinh nhân tạo (còn gọi gieo tinh; sinh sản nhân tạo) là những kỹ thuật đưa tinh trùng (đã được thu nhận, chọn lọc) vào cơ quan sinh dục của con cái (đã được chuẩn bị trước cho việc nhận tinh). Dẫn tinh nhân tạo ra đời nhằm tăng nhanh tốc độ cải tạo di truyền của loài. Do vậy, được phát triển và ứng dụng nhanh vào nông nghiệp.
Ở người, dẫn tinh nhân tạo được sử dụng để điều trị các trường hợp vô sinh liên quan đến quá trình giao phối không (hay khó) xảy ra ở nam cũng như các bệnh ở màng âm đạo, tử cung làm cho tinh trùng giảm hay mất khả năng thụ tinh ở nữ. Ngòai ra, dẫn tinh nhân tạo còn được sử dụng để làm tăng hiệu quả thụ tinh và hạn chế các bệnh lây qua đường sinh dục.
Tùy vào vị trí đưa tinh trùng vào cơ quan sinh dục cái, AI được phân thành bốn hình thức kỹ thuật, bao gồm:
- ITI (IntraTubal Insemination): bơm tinh trùng vào ống dẫn trứng.
- IFI (IntraFollicular Insemination): bơm tinh trùng vào vòi trứng.
- ICI (IntraCervical Insemiantion): bơm tinh trùng vào cổ tử cung.
- IUI (IntraUterine Insemination): bơm tinh trùng vào tử cung.
34 Trong các kỹ thuật dẫn tinh nhân tạo, IUI được sử dụng nhiều và đã được chuẩn hóa. Để tiến hành kỹ thuật này, trước hết tinh trùng được thu nhận, kiểm tra số lượng và chất lượng. Đồng thời, con cái sẽ được theo dõi thời kỳ động dục để sẵn sàng nhận tinh. Nhằm chủ động, các con cái nhận tinh phải được gây rụng nhiều trứng bằng hormone.
Dẫn tinh nhân tạo trên đối tượng động vật có một số thuận lợi: (1) cải tạo được di truyền của loài khi sử dụng tinh trùng giống tốt, (2) phát huy khả năng sử dụng tinh trùng, (3) sau khi con đực chết, tinh trùng vẫn có thể được thu nhận và sử dụng, (4) giảm được các bệnh lây lan qua đường giao phối, (5) tiện lợi và có hiệu quả kinh tế cao.
Bên cạnh đó, kỹ thuật AI cũng gặp phải một số khó khăn: (1) phải phát hiện chính xác thời kỳ động dục của con cái, (2) phải tập huấn cho người thao tác (dẫn tinh viên), (3) cần một số kỹ thuật phụ trợ khác như đông lạnh tinh, các kỹ thuật kiểm tra, đánh giá tinh trùng, đánh giá con vật nhận, theo dõi sau dẫn tinh...
Cần lưu ý: kỹ thuật IUI thực hiện trên người sẽ dễ có nguy cơ đa thai (do gây siêu bào noãn làm chín hơn một trứng) nên người mẹ có thể sinh đôi, sinh ba... Nguy cơ nhiễm trùng khi thực hiện IUI cao nếu bệnh viện không được trang bị hiện đại.
III.2. THỤ TINH IN VITRO (In vitro fertilization_IVF)
Hình 2.6. Quy trình thụ tinh in vitro ở bò (I. Gordon, 2003)
(Môi trường nuôi trưởng thành trứng: TCM-199, Gonadotrophins, Oestradiol, 10% FCS.
Tinh dịch sau khi giải đông được ly tâm rửa một lần bằng dung dịch Percoll, 500 g, 10 phút. Sau khi rửa, tinh trùng được ủ sơ bộ 6 – 8 giờ, để hoạt hóa ở điều kiện 390, 5% CO2).
Thụ tinh trong in vitro là quá trình kết hợp giữa tinh trùng với trứng để tạo ra hợp tử, được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ, tại phòng thí nghiệm (trong hộp lồng, hộp Petri, ống nghiệm). Tuy
Tinh trùng hoạt hóa Nang trứng
Tinh dịch đông lạnh/ giải đông
Cặn tinh trùng 30% Percoll 45% Percoll
Tinh dịch
Ủ sơ bộ trong 6 – 8 giờ, 390C, 5% CO2 (3 triệu tinh trùng/ml)
Trứng trưởng thành (10 – 15 trứng)
Nuôi cấy 390C, 28 giờ, 5% CO2
Thụ tinh (10 triệu tinh trùng/ml)
35 xảy ra ngoài, nhưng các điều kiện cho quá trình IVF như môi trường, nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt, yếu tố dinh dưỡng... cùng các chỉ tiêu sinh học khác phải được đảm bảo bình thường giống như trong cơ thể mẹ.
Các tinh trùng dùng cho thụ tinh in vitro được chuẩn bị theo các phương pháp đã đưa ra ở trên, tùy từng đối tượng. Tuy trong quá trình thụ tinh chỉ có một tinh trùng xâm nhập vào trứng nhưng cần phải có hàng chục tinh trùng xung quanh. Nồng độ tinh trùng có thể được quyết định do số lượng tinh trùng và dung tích của vi giọt môi trường thụ tinh.
Thông thường, môi trường nuôi trứng (đôi khi có huyết thanh) được sử dụng cho giai đoạn thụ tinh và thậm chí cả ở giai đoạn hình thành và phát triển phôi sau này. Tuy nhiên, hiệu quả của việc này không rõ ràng.
Khi thụ tinh in vitro hoặc nuôi phôi, cần thiết phải phủ lên trên bề mặt của môi trường nuôi một lớp dầu khoáng để làm giảm quá trình tạo hạt ngưng tụ trong môi trường, cũng như làm thay đổi nồng độ của các chất. Ngoài ra, lớp dầu khoáng còn có tác dụng như là hàng rào ngăn cản các hạt bụi, vi sinh vật xâm nhập. Một bất lợi của việc sử dụng lớp dầu khoáng là ngăn cản sự khuếch tán của khí CO2 vào môi trường nuôi. Do vậy, cần nhiều thời gian hơn để tạo sự cân bằng của của khí trong pha khí của tủ ấm và môi trường.
* Các hệ thống thụ tinh in vitro
Ba yếu tố quan trọng trong một hệ thống thụ tinh in vitro: (1) dụng cụ thụ tinh, (2) môi trường thụ tinh, (3) và các điều kiện khác (khí, nhiệt độ và độ ẩm môi trường…). Dụng cụ thường dùng bằng nhựa có chất lượng tốt, được kiểm tra chất lượng kỹ càng với những thử nghiệm về chất gây sốc và gây độc.
Thụ tinh trong ống nghiệm 5 ml: sử dụng ống ly tâm nhựa 5ml với nắp mở được vặn lỏng, do đó giúp kiểm soát tốt pH và áp suất thẩm thấu. Nồng độ tinh trùng tối ưu là 50.000 tinh trùng di động/1OCC. Hạn chế của hệ thống này phải chuyển mẫu sang đĩa khác mới có thể kiểm tra sự thụ tinh.
Thụ tinh trong đĩa một giếng hay bốn giếng: thêm một thể tích huyền phù tinh trùng đã đo trứơc vào mỗi giếng của đĩa 4 giếng (hay đĩa một giếng) với nồng độ trung bình 100.000 tinh trùng di động tiến/giếng, ủ qua đêm rồi rửa trứng để loại bỏ các tinh trùng thừa. Hạn chế của hệ thống này là khó thực hiện đối với các trường hợp mẫu có số lượng tinh trùng ít (vì không thể cho nhiều hơn 0,5ml môi trường trong mỗi giếng).
Thụ tinh trong ống mao quản và cọng rạ: sử dụng một cọng rạ hay ống mao quản nhỏ để đồng ủ tinh trùng và trứng. Sau khi thụ tinh, dùng pipette đẩy hết dung dịch chứa trong ống mao quản hay cọng ra vào trong đĩa 1 giếng hay 4 giếng để kiểm tra. Ưu điểm của phương pháp này là tiết kiệm được trứng và tinh trùng.
Thụ tinh trong vi giọt: đưa mỗi OCC vào một vi giọt đó được chuyển bị sẵn từ 20 – 50 àl huyền phù tinh trùng dưới lớp dầu, sau đó ủ trong tủ ấm 5% CO2 và 370C. Các vi giọt có thể được chuẩn bị trong đĩa petri nhỏ, đĩa một giếng hay bốn giếng vô trùng. Đây là phương pháp phổ biến nhất vì khá đơn giản, an toàn mà vẫn đem lại hiệu quả cao, đặc biệt rất hữu ích cho những trường hợp mẫu ít tinh trùng. Khó khăn chính là yêu cầu người thao tác phải có kinh nghiệm.
Tùy theo thói quen tiến hành cũng như điều kiện của các phòng thí nghiệm để thao tác cho tinh trùng vào trong môi trường có trứng đã chuẩn bị sẵn trong giọt thụ tinh hay ngược lại. Việc chuyển tinh trùng vào môi trường trứng thường được tiến hành trên động vật, ngược lại, việc chuyển trứng vào tinh trùng thường tiến hành trên người.
36
* Đánh giá kết quả thụ tinh
Ghi nhận kết quả, đánh giá sự thụ tinh ngay ở ngày thứ nhất bằng quan sát hiển vi và có thể tiến hành phẫu tích phôi nếu cần thiết. Để dễ dàng quan sát, các trứng đã được thụ tinh nên được phẫu tích sau 17 – 20 giờ để đánh giá.
Sự thụ tinh thường được đánh giá bởi sự hiện diện của hai tiền nhân và hai thể cực trong trứng. Ngoài ra, cũng có thể quan sát thấy những biểu hiện hình dạng đặc thù như: màng zona pellucida đầy đặn; nguyên sinh chất khỏe mạnh và sạch, có thế biểu hiện từ màu nâu đến đen; hình dạng có thể khác (từ hình cầu đến những kiểu hình không đặc trưng); có một vành sáng rõ nguyên sinh chất ngoại vi dày chừng 5–10 àm.
Các chi tiết về hình dạng và sự thụ tinh nên được ghi nhận tiếp tục vào ngày thứ 2 cho mỗi hợp tử quan tâm, khi muốn chọn chúng để chuyển (cấy phôi).
Tách các hợp tử thụ tinh bình thường tại thời điểm ghi nhận ở các giọt thụ tinh hay các giếng ban đầu, chuyển vào các giếng mới hay các đĩa mới đã được thay môi trường tốt.
Các bất thường khác cũng đã được quan sát:
- Trứng chưa trưởng thành với túi mầm hay không có túi mầm hoặc thể cực (trứng metaphase I) được thấy xen lẫn giữa các trứng sau khi thu nhận và thụ tinh.
- Các trứng xuất hiện với ba tiền nhân thường phát triển bất thường và có những sai lệch nghiêm trọng trong nhiễm sắc thể bởi vì hình thành tới ba thoi vô sắc.
- Các trứng với một tiền nhân và hai thể cực được hoạt hóa và thường chứa đầu tinh trùng đang xoắn chặt hay tháo xoắn một phần.
- Trứng một tiền nhân và một thể cực: nếu không thấy hình thành thể cực thứ hai, trứng này thường không có khả năng phát triển, nên loại bỏ chúng.
Sự tái thụ tinh: Các trứng không xuất hiện (hoặc không quan sát được) tiền nhân có thể được tái thụ tinh. Sự thụ tinh hay sự phân cắt thường được xác nhận vào ngày thứ hai, nhưng điều này có thể là kết quả của quá trình thụ tinh của lần đầu tiên. Cũng không loại trừ khả năng nảy sinh sự chậm trễ thụ tinh do các khiếm khuyết chức năng tinh trùng hoặc sự trưởng thành trễ của trứng.
Những phôi này nói chung cần chẩn đoán trước khi cho làm tổ.
III.3. GIFT (GAMTE INTRAFALLOPIAN TRANSFER)
Kỹ thuật liệu pháp giao tử (GIFT) được giới thiệu lần đầu tiên năm 1984 bởi Ricardo Asch (Mỹ), trong đó, một hay nhiều trứng trộn với tinh trùng đã được hoạt hóa và lọc sạch được tiêm vào trong vòi dẫn trứng. Như vậy, sự thụ tinh xảy ra tại ống dẫn trứng của cơ thể mẹ chứ không phải trong ống nghiệm như trong kỹ thuật IVF.
GIFT được thực hiện qua ba bước:
- Kích thích rụng trứng nhiều.
- Trứng và tinh trùng sau khi thu nhận được đáng giá chất lượng và xếp loại, tinh sạch và hoạt hóa, sử dụng các tế bào tốt.
- Chuyển giao tử: một khi tinh trùng và trứng đã sẵn sàng cho thụ tinh, chúng được trộn chung lại để chuyển vào ống dẫn trứng.
Thuận lợi của GIFT là tinh trùng và trứng gặp nhau trong ống dẫn trứng, nơi xảy ra sự thụ tinh tự nhiên. Tuy nhiên, do cần phải tiến hành nội soi cũng như sự hỗ trợ của các kỹ thuật khác
nên GIFT tốn kém. Mặt khác không thể trực tiếp theo dõi quá trình thụ tinh nên không biết được nếu sự thụ thai không xảy ra thì nguyên nhân do yếu tố nào. Tỷ lệ thành công của GIFT cao hơn không đáng kể so với IVF. Có thể chỉ đơn giản là sự thụ tinh xảy ra trong môi trường cơ thể (tự nhiên) tốt hơn trong môi trường ống nghiệm (nhân tạo).
III.4. VI THỤ TINH (MICROINSEMINATION)
Hình 2.7. Các phương pháp vi thụ tinh III.4.1. Khoan màng zona (ZD_zona drilling)
Khoan thủng một lỗ nhỏ trên màng zona bằng acid tyrode với một micropipette nhọn(acid làm hòa tan màng), rau đó rửa trứng vài lần bằng môi trường nuôi cấy mới (để trung hòa acid) rồi lấy trứng này thụ tinh in vitro. Ngoài ra, cũng có thể dùng trypsin hay pronase để phá màng zona.
Phương pháp này cho tỷ lệ thụ tinh cao hơn với mật độ tinh trùng thấp trong IVF ở chuột, tuy nhiên, ở người, kết quả thu được không khả quan – sự thụ tinh xảy ra nhưng phôi có chất lượng kém nên khó phát triển thành thai.
III.4.2. Tách bỏ một phần màng trong suốt (PZD – Partial Zona Dissection)
Dùng một ống hút đầu nhọn đâm vào màng zona tại vị trí 1 giờ và xuyên ra ngoài tại vị trí 11 giờ. Dùng một ống hút khác giữ để lấy đi phần màng trong suốt nằm ở phía trên của ống hút đầu nhọn. Các noãn xử lý theo cách này có thể phát triển bình thường sau khi thụ tinh, phôi cũng phát triển thành thai bình thường.
Phương pháp này không được coi là tiến bộ trong kỹ thuật vi thụ tinh vì:
- Tạo lỗ tương đối lớn ở vùng màng trong suốt khiến phôi được tạo ra có chất lượng kém, làm tổ không tốt.
- Các tinh trùng yếu và tinh trùng bất thường có mặt trong các mẫu tinh dịch cũng sẽ dễ dàng xâm nhập vào trứng.
- Có thể nhiều tinh trùng cùng lúc chui vào trứng.
SUZI ICSI
ZD PZD
Vị trí 11 giờ Vị trí 1 giờ holding pipette
injection pipette Khoang noãn
Thể cực
Tế bào Vị trí 3 giờ
38 III.4.3. Tiêm tinh trùng vào dưới màng trong suốt (SUZI – Surzonal sperm injection)
Dùng một ống hút nhỏ đưa thẳng tinh trùng xuyên qua màng torng suốt vào trong khoảng không quanh noãn tương.
Các thử nghiệm đầu tiên thường tiêm chỉ một tinh trùng, kết quả không khả quan. Sau đó, người ta tiêm từ 2 đến 3 tinh trùng, kết quả thụ tinh tăng lên nhưng kèm theo là nguy cơ đa thụ tinh cũng tăng. Để giải quyết vấn đề này, kỹ thuật loại bỏ tiền nhân thừa được thử nghiệm.
III.4.4. Bơm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI – Intracytoplasmic sperm injection)
- Thu nhận một tinh trùng di động trong môi trường vào một kim nhọn (đuôi vào trước), hút vào và đẩy ra vài lần cho đến khi tinh trùng bất động, sau đó hút sâu tinh trùng vào bên trong pipette (hạn chế tối đa môi trường đi theo).
- Dùng pipette holding để giữ trứng (sao cho vùng nhô lên của trứng ở vị trí 12 giờ hay 6 giờ).
- Dùng mũi kim nhọn (chứa tinh trùng) đâm thủng màng zona tại vị trí 3 giờ. Khi pipette xuyờn chừng 1/3 đến ẵ đường kớnh trứng thỡ đẩy nhanh kim về phớa trước, cựng thời điểm đú vỏ trứng được kéo về phía pipette giữ.
- Đẩy tinh trùng vào trong noãn tương rồi cẩn thận rút pipette ra ngoài.
- Nuôi trứng trong tủ CO2. Sau 16 – 18 giờ kiểm tra thụ tinh. Kiểm tra lần thứ hai vào ngày hôm sau để đánh giá sự phát triển của phôi.
Hình 4.34. Quy trình ICSI Hình 2.8. Quy trình ICSI
* Hạn chế của ICSI
Bên cạnh những lợi ích do ICSI mang lại, nó cũng chứa đựng nhiều nguy cơ. Thứ nhất, đó là sự lan truyền những bệnh di truyền tiềm ẩn, bởi vì bệnh vô sinh nam thường do sự bất thường về NST hay những bất thường khác về mặt di truyền. Thứ hai là sự không nhất quán về tinh trùng.
Thứ ba, sự thụ tinh không hoàn chỉnh. Thứ tư, sai lệch sự biểu hiện gen, trường hợp này thường xảy ra khi sử dụng tinh trùng chưa trưởng thành.
III.4.5. ROSI (Round spermatid injection)
ROSI là kỹ thuật ICSI nhưng sử dụng các tinh trùng hình tròn không có đuôi (các tế bào hình thành trong quá trình sinh tinh, mang bộ NST 1n
39 III.4.6. Đánh giá sự thụ tinh và phân cắt
16 đến 18 giờ sau khi tiêm, tiến hành đánh giá số lượng và hình dạng của tiền nhân thông qua kính hiển vi đảo ngược, bằng cách dùng một mũi kim thủy tinh xoay nhẹ trứng.
Tiếp tục kiểm tra các phôi phân cắt sau 24 giờ nuôi cấy. Chuyển phôi được đánh giá bình thường hay không vào khoảng 48 giờ sau vi tiêm. Các phôi thích hợp cho đông lạnh hoặc là vào ngày 1 (giai đoạn tiền nhân) hoặc ngày 2 (giai đoạn phân cắt sớm). Sự thụ tinh ít khi thất bại đối với ICSI, hầu hết các trường hợp thất bại liên quan đến tinh dịch chứa các tinh trùng không di động hay tinh trùng đầu tròn. Sự thụ tinh thất bại có thể chất lượng trứng kém.
Việc sử dụng các tế bào tinh trùng từ mào tinh hay tinh hoàn (nói chung các tinh trùng chưa trưởng thành) làm giảm tỷ lệ thụ tinh và mang thai. ROSI cho thấy tỷ lệ thụ tinh trong khoảng 17–
27%, thấp hơn so với các tế bào tinh trùng trưởng thành.