CHƯƠNG 3 CÔNG NGHỆ TẠO DÒNG VÔ TÍNH
III. CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG TẠO DÒNG IN VITRO
Với nhiều quy trình kỹ thuật, 75% sự thành công của các thí nghiệm tạo dòng là do dụng cụ thao tác tốt. Có nhiều dụng cụ, thiết bị được sử dụng chung trong công nghệ hỗ trợ thụ tinh ICSI.
Kỹ thuật vi thao tác (micromanipulation technique), được coi là chìa khóa của tạo dòng vô tính in vitro ở động vật, cấp độ phôi và tế bào.
Nhìn chung, trong công nghệ tạo dòng vô tính in vitro trên động vật hữu nhũ đều sử dụng noãn bào trưởng thành đã được loại bỏ nhân 1n với các thủ pháp điển hình sau:
III.1. Tách phôi (embryo spitting)
Một phôi có thể được tách (in vitro) bằng vi thao tác thành hai hay nhiều phần tương đối bằng nhau, thậm chí là tách thành từng tế bào riêng rẽ.
Phôi ở giai đoạn cuối của phôi dâu hoặc giai đoạn đầu của phôi nang sẽ cho kết quả tách đôi cao hơn các giai đoạn sau. Khi cắt phôi ở các giai đoạn muộn hơn, tế bào phôi đã biệt hóa hình thành nên các lá phôi nên xác xuất cho một cơ thể trọn vẹn khó được đảm bảo, thông thường thai bị chết trước khi sinh.
Để tách rời các tế bào của phôi, cần thực hiện ở giai đoạn sớm (thường là 2 – 4 hay 8 tế bào) và mỗi tế bào sẽ có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh với điều kiện thích hợp với chúng.
Hình 3.4. Chiến lược tạo dòng bằng tách phôi thành các tế bào đơn
* Ý nghĩa của tách phôi:
- Tăng nhanh số lượng phôi từ một phôi ban đầu, điều này giúp người chăn nuôi có được nhiều con giống hơn, đặc biệt là những con giống nhau về mặt di truyền.
- Giúp xác định giới tính sớm của vật nuôi.
- Giúp cho các vấn đề nghiên cứu cơ bản và ứng dụng khác phát triển.
Tuy nhiên, số lượng phôi tăng lên từ kỹ thuật tách, cắt không nhiều.
III.2. Chuyển nhân (nuclear transfer)
Chuyển nhân là kỹ thuật then chốt của công nghệ tạo dòng động vật, trong đó, nhân tế bào sinh dưỡng của cơ thể trưởng thành (hay của tế bào phôi) được thu nhận và chuyển vào trứng trưởng thành đã loại bỏ nhân). Kỹ thuật này giúp tạo các dòng tế bào mới, và nếu tiếp tục phát triển, một “phôi” mới sẽ hình thành để cho ra một cá thể mới thông qua cấy phôi. Cá thể con ra đời có “bản sao” DNA chính xác của cơ thể mẹ đã cung cấp nguồn tế bào sinh dưỡng ban đầu nói trên.
Hình 3.5. Tiến trình chuyển nhân tạo cừu Dolly Các tế bào của một phôi ban đầu Tế bào phôi
được tách rời
Phát triển thành phôi
Cấy phôi vào các con nhận khác nhau
Các cá thể con ra đời giống nhau
49
* Quy trình chuyển nhân được khái quát gồm năm bước sau:
a) Bước 1: Chuẩn bị cytoplast: Các tế bào trứng chưa thụ tinh được sử dụng như là tế bào nhận nhân mới, sau khi loại bỏ nhân của chính chúng. Các trứng này thường được thu nhận bằng phương pháp chọc hút buồng trứng, sau đó, nuôi trưởng thành in vitro và cuối cùng loại bỏ nhân.
Hình 3.6. Loại nhân tế bào trứng
(a) Trứng (chưa thụ tinh) được ủ với thuốc nhuộm DNA để định vị DNA
(b) Pipette giữ trứng và pipette xuyên màng ZP hút nhiễm sắc thể và thể cực thứ nhất (c) Trứng đã loại bỏ nhân, chỉ còn chứa chất nguyên sinh (cytoplast)
b) Bước 2. Chuẩn bị tế bào cho nhân: Các tế bào cho có thể lấy từ nhiều nguồn khác nhau với nhiều mức độ biệt hóa khác nhau (tế bào tuyến vú, tế bào mô cơ, tế bào gốc biểu mô, tế bào đuôi, tế bào granulosa, tế bào gan, tế bào thần kinh vỏ não, tế bào tử cung, tế bào mô tinh hoàn, mô gờ sinh dục, tế bào gốc da, mô da, tế bào cumulus, tế bào mầm sinh dục, tế bào gốc, tế bào máu, tế bào mũi...)
Hình 3.7. Phương pháp thu nhận nhân (2n) của tế bào sinh dưỡng
Các tế bào cho nhân được nuôi cấy in vitro và tạo sự phù hợp (về chu kỳ tế bào) với trạng thái nguyên sinh chất của trứng. Trong vài trường hợp, người ta bỏ đói tế bào cho nhân để đưa chúng về chu kỳ mong muốn.
c) Bước 3. Chuyển nhân: Thông thường là dung hợp màng của tế bào cho và tế bào trứng.
Có ba kỹ thuật phổ biến: kích thích xung điện, xử lý hóa chất (polyethylene glycol – PEG), dùng virus Sendai.
a b c
50 d) Bước 4. Hoạt hóa phôi: Phôi một tế bào hình thành được hoạt hóa bằng các tín hiệu hóa học hay xung điện để khởi động quá trình phát triển tiếp theo. Tín hiệu thường dùng là ionomycin, ethanol, thimerosal, inositol 1,4,5-triphosphate, calcium ionophore 23178. Ngoài ra, dịch chiết tinh trùng cũng có thể được sử dụng.
e) Bước 5. Nuôi và cấy phôi: Phôi sau khi đã hoạt hóa, được nuôi cấy in vitro với môi trường thích hợp. Sau thời gian này, phôi sẽ phát triển tới blastocyst (khoảng 120 tế bào), đây là giai đoạn thích hợp cho cấy truyền.
III.3. Chuyển tế bào sinh dưỡng
Thay vì chuyển nhân, một tế bào 2n nguyên vẹn được chuyển thẳng vào noãn bào trưởng thành (đã được làm mất nhân) bằng vi thao tác hoặc vi thao tác có hỗ trợ xung điện (Piezoelectric assisted nuclear transfer).
Hình 3.8. Chuyển tế bào vào trứng đã loại nhân (a) Tế bào fibroblast được lựa chọn, hút vào trong pipette.
(b) Đâm pipette vào màng zona, tế bào được đặt vào khoảng giữa ZP và cytoplasm.
(c) Rút nhẹ nhàng pipette ra.
III.4. Dung hợp (fusion)
- Dung hợp (fusion) trứng với tế bào 2n: về bản chất, trường hợp này giống với chuyển tế bào, chúng chỉ khác nhau về cách chuyển. Dung hợp tế bào với trứng (đã loại nhân) có thể được thực hiện bằng nhiều cách khác nhau, trong đó việc dùng xung điện được tiến hành phổ biến hơn.
III.5. Trinh sản
- Tạo dòng vô tính ở động vật bằng kỹ thuật trinh sản (Parthenogenesis technique) với các tác nhân kích thích lý học, hóa học hay cơ học... đã phát triển rất sớm và gặt hái nhiều thành tựu, đóng góp vào sự thành công chung của lĩnh vực tạo dòng vô tính.
Có nhiều tác nhân được xác định có khả năng kích thích trinh sản: tia điện, châm kim, các lực cơ học, áp suất thẩm thấu, nhiệt độ...
Đã có nhiều báo cáo kích thích trinh sản thành công trên nhiều động vật, kể cả động vật có vú như thỏ, chuột nhắt, heo…
a b c
51 Hình 3.9. Các dạng phôi được tạo bằng phương pháp trinh sản
(a) Phôi heo blastocyst đang thoát nang và phát triểnsau khi IVM 44 giờ, được kích thích liờn tục 3 xung điện 80-àsec, 1,0 kV/cm DC. Sau đú xử lý Cytochalasin B 7 àg/ml trong 6 giờ để cảm ứng lưỡng bội hóa (Jie Zhu và cs, 2001). (b) Phôi chuột cống được hoạt hóa bằng strotinum phát triển đến giai đoạn 2 tế bào. (Otaegui và cs, 1999)