CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP
2.2.5. Đo hàm lượng đường tan, tinh bột, acid hữu cơ và carotenoid
Nhằm xác định hàm lượng đường, tinh bột, acid hữu cơ và carotenoid trong trái ở mỗi giai đoạn trong quá trình chín trái.
Đo hàm lượng đường tổng số
- Lập đường chuẩn với saccharose
Pha saccharose theo các nồng độ từ 10- 80 mg/l. Nhuộm dung dịch saccharose bằng phenol 5% và H2SO4 đậm đặc theo tỉ lệ saccharose: phenol 5%: H2SO4 đđ (1:1:5 v/v/v). Đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 490 nm với chuẩn là nước cất: phenol 5%:
H2SO4 (1:1:5 v/v/v).
Hàm lượng đường được ly trích và đo ở trái ở các giai đoạn chín khác nhau.
Nghiền 1g vật liệu. Chiết đường bằng cồn 900 nóng theo tỉ lệ cồn: mẫu (10:1 v/v). Lọc. Lặp lại 3 lần. Tiếp tục chiết đường còn lại trong phần bã bằng cồn 800 nóng.
Lặp lại 2 lần. Cô cạn các dịch lọc thu được rồi pha loãng với nước cất để thực hiện phản ứng màu với phenol 5% và H2SO4 đđ theo tỉ lệ 1: 1: 5 (v/v/v). Đo mật độ quang ở bước sóng 490 nm. Tính hàm lượng theo đường saccharose chuẩn (Coombs et al.,1987).
Đo hàm lượng tinh bột
Bã còn lại từ các trái ở trên sấy khô 800C trong 30 phút. Thêm 5 ml nước cất vào bã và đun cách thủy 15 phút. Lấy mẫu ra và để nguội.
Thủy phân bã bằng cách cho 2 ml acid percloric 9,2 N trộn đều trong 15 phút.
Thêm nước vào hỗn hợp cho đủ 10 ml dung dịch. Li tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 4 phút. Để riêng dịch lọc (1). Tiếp tục trích bã 3 lần với acid percloric 4,6 N pha loãng thành 10 ml rồi li tâm thu được dịch lọc (2). Gộp chung dịch lọc (1) và (2) sau đó tiến hành xác định hàm lượng đường theo đường chuẩn với đường mẫu glucose.
Qui đổi ra hàm lượng tinh bột theo công thức (Coombs et al.,1987):
a : lượng đường glucose sau khi thủy giải.
b : độ pha loãng.
0,9 : hệ số chuyển thành tinh bột.
100 : tính ra phần trăm.
n : trọng lượng mẫu lấy phân tích.
Tinh bột (%) =
n x axbx 0 , 9 100
Đo hàm lượng acid hữu cơ
Nghiền 5g trái mỗi giai đoạn chín với 30 ml nước cất (10 lần lặp lại). Đun cách thủy 15 phút, để nguội, lọc. Thêm vào bã 20 ml nước cất, đun cách thủy 15 phút. Để nguội, lọc. Thêm nước cất vào các dịch lọc cho tới 100ml. Lấy 20 ml dịch lọc, thêm vào vài giọt phenolphtalein, xác định lượng acid hữu cơ với NAOH 0,01 N. Hàm lượng acid được tớnh theo đương lượng acid: àeq/g trọng lượng tươi (Bựi Trang Việt và cộng sự, 2000).
Đo hàm lượng carotenoid có trong vỏ trái
Nghiền 1g vỏ trái mỗi giai đoạn chín. Bổ sung thêm 3 ml aceton và 0,2 g Na2SO4 (10 lần lặp lại). Lọc và đo thể tích dịch lọc. Mật độ quang được đo ở bước sóng 470 nm, 644,8 nm và 661,6 nm bằng máy đo UV. Hàm lượng carotenoid tổng số được tính theo công thức (Boyer, 1993):
C (mg/g)= Cx × a × V × 100/m
Với Cx= 1000 A470 −1,90 × Ca −63,14 Cb 214
Ca= 11,24 × A661,6 – 2,04 × A644,8 Cb= 20,13 × A 644,8 – 4,19 × A 661,6 V: thể tích dịch trích carotenoid.
a: hệ số pha loãng.
m: khối lượng cân ban đầu
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh được ly trích và phân đoạn theo Bùi Trang Việt (1992); Ley et al. (1963); Loveys, Van Dijk (1988); Meiner (1984) và Yokota et al. (1980).
Ly trích và phân đoạn
Nghiền 3g trái mỗi giai đoạn chín. Ly trích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật của trái trong mỗi giai đoạn, dựa trên sự thay đổi pH và dung môi (methanol). Thực hiện trong ánh sáng đỏ (Bùi Trang Việt, 1989) (hình 2.4).
Hình 2.4. Sơ đồ ly trích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Bùi Trang Việt 1989).
Mẫu nghiền với methanol 80%
Hòa tan trong 5ml nước cất
cô cạn 1 ml
pH 2,5; Ether
Dịch nước
Dịch nước (bỏ) Ether
Sắc ký
Zeatin
pH 7; Ether Ether
Ether Dịch nước
(bỏ)
IAA, ABA, GA3
NaHCO3 8%
Sắc ký
Sắc ký bản mỏng
Phân ly các chất ly trích bằng phương pháp sắc ký trên bản mỏng silica gel F254
(20x20 cm) để phân tách các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Dung môi di chuyển có tỉ lệ chloroform: methanol: acid acetic = 80:15:5 (v/v/v) (Yokota et al.,1980). Sau khi phân li ở 250C, bản silica gel được chia thành 10 băng bằng nhau (tính từ mực gốc đến vạch dung môi). Ngâm từng băng giấy sắc kí trong nước cất để có các dung dịch được dùng trong các sinh trắc nghiệm. Chuẩn là dịch trích chứa băng silica gel dưới mực gốc.
Vị trí các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được nhận diện bằng phương pháp chiếu tia UV 254 nm (auxin, abscisic acid và cytokinin), phun hỗn hợp H2SO4: etanol
= 5:95 (v/v) (gibberellin) và quan sát dưới tia UV (Yokota et al.,1980) rồi so với bản sắc kí chứa dung dịch các chất điều hòa sinh tăng thực vật dạng hỗn hợp.
Sinh trắc nghiệm
Đo hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ở vật liệu sau khi ly trích và phân đoạn qua sắc kí bản mỏng: gồm các chất trích từ trái cà phê (ở các giai đoạn chín khác nhau) trong 10 băng trên bản mỏng silica gel.
Hoạt tính auxin và abscisic acid (ABA) được đo bằng sinh trắc nghiệm khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) (Bùi Trang Việt, 1989; Nguyen Thi Ngoc Lang, 1970).
Hạt lúa gieo trên bông ẩm trong tối ở nhiệt độ 310C ± 20C và đo chiều dài sai biệt sau 24 giờ. Hoạt tính auxin tỷ lệ thuận với chiều dài khúc cắt diệp tiêu trong IAA tinh khiết 1 mg/l, hoạt tính ABA tỷ lệ nghịch với chiều dài khúc cắt diệp tiêu trong ABA tinh khiết 1 mg/l.
Hoạt tính gibberellin được đo bằng sinh trắc nghiệm trụ hạ diệp cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.). Gieo hạt xà lách trên bông ẩm, nhiệt độ khoảng 310C. Sau 18 giờ chọn hạt có rễ mầm vừa lú ra khỏi vỏ đặt trong các cốc thủy tinh nhỏ (100 ml) chứa dịch trích sau sắc ký. Các cốc thủy tinh được đặt dưới ánh sáng liên tục 2500 lux ± 500 lux, nhiệt độ 280C ± 20C. Sau 72 giờ, đo sai biệt chiều dài trụ hạ diệp so với chuẩn.
Hàm lượng gibberellin tỷ lệ thuận với chiều dài trụ hạ diệp trong GA3 tinh khiết 1 mg/l.
(Cucumis sativus L.). Hạt dưa leo gieo trong tối, trên bông ẩm, ở nhiệt độ 31 C ± 2 C.
Khi rễ mầm vừa lú ra khỏi vỏ hạt, thu các tử diệp, cân 10 tử diệp và đặt trên giấy thấm ẩm chứa dịch trích cytokinin ở 280C ± 20C, ánh sáng liên tục 2500 lux ± 500 lux. Sau 48 giờ, đo và tính sai biệt trọng lượng tử diệp so với chuẩn. Hoạt tính zeatin tỷ lệ thuận với trọng lượng sai biệt của tử diệp dưa leo so với chuẩn nước cất và zeatin tinh khiết 1 mg/l.
2.2.7. Xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên trái trong phòng thí nghiệm
Sử dụng đĩa Petri, bên trong đặt 7 lớp giấy thấm. Đổ vào đĩa 10 ml nước cất.
Trái cà phê ở đầu giai đoạn bắt đầu chín (màu cam chiếm khoảng 20% vỏ) được nhúng vào dung dịch các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: IAA 2,5, 5,10 mg/l; NAA 1, 2, 5 mg/l, BA 5, 10, 20 mg/l; GA3 5, 10, 20 mg/l và ethrel 50, 100, 200 mg/l trong 30 giây sau đó cắm cuống trái vào giấy thấm. Lặp lại sau 48 giờ. Thêm nước hằng ngày.
Mỗi nghiệm thức 5 trái lặp lại 5 lần.
Quan sát thời gian trái cần để chín (đổi từ màu xanh-cam thành màu đỏ).
2.2.8. Xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên trái ngoài vườn 2.2.8.1. Xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên trái riêng rẽ
Xử lý các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nồng độ như mục 2.2.7 lên trái giai đoạn trưởng thành (màu xanh) nằm riêng lẻ trên cành. Sử dụng tăm bông bôi lên toàn bộ bề mặt trái vào 5g sáng. Lặp lại sau 48 giờ.
Mỗi nghiệm thức 30 trái lặp lại trên 3 cây ngẫu nhiên trong vườn.
Ghi nhận lại thời gian trung bình trái cần để chuyển từ giai đoạn trưởng thành sang chín (từ màu xanh thành màu đỏ). Sau 10, 15, 20 ngày đếm số trái chuyển sang màu đỏ để xác định tỷ lệ trái chín ở mỗi nghiệm thức.
2.2.8.2. Xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên cành mang trái
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cho kết quả tốt sẽ được lựa chọn để xử lý lên cành mang trái.
Trước khi xử lý chọn những cành ở giữa cây theo các hướng khác nhau, trên cành có khoảng 70% là trái trưởng thành, một số trái bắt đầu chuyển màu. Đếm số trái non và trái trưởng thành trên cành trước khi xử lý.
Dùng bình phun và phun trực tiếp dung dịch lên trái trên cành xử lý vào lúc sáng sớm. Điều kiện thời tiết không mưa. Phun cách 48 giờ/ lần.
Mỗi nghiệm thức 5 cành lặp lại trên 3 cây.
Ghi nhận tỷ lệ trái non bị rụng và trái chín đỏ trên cành sau 2 tuần xử lý.
2.2.8.3. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của trái sau xử lý
Đo kích thước của trung bình của 1 trái cà phê giai đoạn chín trong mỗi nghiệm thức xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật và đối chứng (nước cất).
Trọng lượng tươi và khô trung bình của một trái cà phê giai đoạn chín trong mỗi nghiệm thức và đối chứng được thực hiện như mục 2.2.3. Lặp lại 10 lần trên 10 trái.
2.2.9. Đánh giá thống kê
Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 dùng cho windown để phân tích số liệu và đánh giá thống kê với sai khác có ý nghĩa p=0,05.