CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.2.5. Sàng lọc các chủng E. coli sinh men β- lactamse bằng đĩa Nitrocefin
- Trình bày :
Đĩa Nitrocefin được đóng trong lọ nắp chặt có chất hút ẩm, mỗi lọ chứa 50 đĩa.
- Nguyên tắc:
Những vi khuẩn sinh men β-lactamase sẽ làm đĩa Nitrocefin chứa đài chất là nitrocefin, là một kháng sinh thuộc họ cephalosporin đổi từ vàng sang đỏ. Kết quả thử nghiệm này dễ dàng phát hiện bằng mắt thường.
- Cách thực hiện:
Dùng kẹp sạch lấy một đĩa β-lactamase quệt trực tiếp lên khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần thử nghiệm.
Quan sát sự đổi màu của đĩa β-lactamase.
- Cách đọc kết quả:
[-]: nếu đĩa không có sự thay đổi màu.
[+]: nếu quệt khúm vi khuẩn trên đĩa, đĩa chuyển từ màu vàng sang đỏ. Ở hầu hết các vi khuẩn thì sự thay đổi màu không quá 5 phút. Tuy nhiên một số chủng Staphylococci có thể đến 1 giờ.
https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/content/hugo/NitrocefDisks.htm
Hình 2.6. Thử nghiệm men β-lactamase
2.2.6. Phương pháp PCR phát hiện gene mã hóa cho tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli
Mục đích: Phát hiện một số gene mã hóa tính kháng kháng sinh của vi khuẩn.
Nguyên tắc: Sử dụng đoạn mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gene mã hóa enzyme tính kháng kháng sinh của vi khuẩn. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để tổng hợp hàng triệu bản sao của đoạn gene từ một vài phân tử ADN ban đầu, qua đó có thể phát hiện các đoạn gene dưới đèn UV sau khi điện di.
Thực hiện:
a. Tách chiết ADN từ chủng vi khuẩn
Nguyên tắc: sự tăng hoặc giảm nhiệt độ môi trường một cách đột ngột làm cho cơ chế tự bảo vệ cân bằng của tế bào không kịp điều chỉnh phá vỡ màng tế bào.
Hóa chất:
- Dung dịch Tris HCl 10 mM (pH 8,0).
Thiết bị và dụng cụ:
- Tăm bông vô trùng.
- Máy ủ nhiệt (Biosan – Latvia).
- Eppendorf 1,5 ml, 0,5 ml.
- Máy đo độ đục.
Thực hiện:
Thực hiện theo qui trình tách chiết ADN vi khuẩn Gram âm chuẩn của CDC.
- Hút 1,0 ml Tris-HCl 10mM (pH 8,0) vào eppendorf 1,5ml, ghi tên.
- Dùng que cấy lấy khuẩn lạc nuôi cấy trên thạch TSA 18 – 24 giờ hòa vào dung dịch Tris-HCl đã có sẵn để tạo huyền dịch có độ đục 3,0.
- Vortex kỹ và ủ bằng máy ủ nhiệt ở 100°C trong 10 phút.
- Lấy eppendorf ra khỏi máy ủ nhiệt, tách ADN từ eppendorf 1,5 ml sang 0,5ml.
- Bảo quản ADN ở - 20°C.
b. Thực hiện phản ứng PCR
- Nguyên tắc: phương pháp PCR được hình thành dựa vào đặc tính của các ADN polymerase. Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một đoạn ADN mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của các mồi chuyên biệt.
- Hóa chất:
Top Taq Master-Mix (Quigen – Mỹ)
Primer (AIT – Singapore).
- Pha primer:
+ Primer dạng bột khô được cộng thêm một lượng TE 1x phù hợp để đạt nồng độ100μM (theo khuyến cáo của nhà cung cấp).
+ Nồng độ làm việc 25 μM: hút 25 μl primer 100 μM + 75 μl H2O không RNase.
- Trình tự primer, gene mục tiêu và chiều dài gene mục tiêu tương ứng với 4 cặp primer:
Bảng 2.1. Trình tự primer, gene mục tiêu và chiều dài gene mục tiêu
STT TÊN
GENE TRÌNH TỰ PRIMER (5’ – 3’) KÍCH THƯỚC
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 blaTEM-186 F:5′-TCGGGGAA ATGTGCGCG-3′
R:5′-TGCTTAATCAGTGAGGCACC-3′ 972 [47,58]
2 blaSHV-12 F: 5′-TTA TCT CCC TGT TAG CCA CC-3′
R: 5′-GAT TTG CTG ATT TCG CTC GG-3′ 797 [38]
3 tetA F:5’- GGTTCACTCGAACGACGTCA-3’
R:5’- CTGTCCGACAAGTTGCATGA-3’ 577 [45]
4 tetB F:5’- CCTCAGCTTCTCAACGCGTG-3’
R:5’- GCACCTTGCTGATGACTCTT-3’ 634 [45]
- Pha hỗn hợp phản ứng PCR:
Bảng 2.2. Thành phần cho mỗi phản ứng PCR Thành Phần Thể tích/1 phản ứng Toptaq Master mix 2x 12,5 μl
Primer F 0,5 μl
Primer R 0,5 μl
H2O không RNase 6,5 μl
ADN khuôn mẫu 5 μl
Tổng thể tích 25 μl
- Chu trình nhiệt cho mỗi cặp primer:
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cho mỗi cặp primer
Giai đoạn Primer 1 Primer 2 Primer 3 Primer 4 Tiền biến tính 940C: 3 phút 950C: 3 phút 940C: 3 phút 950C: 7phút
Biến tính 940C: 30 giây 940C: 1 phút 940C: 30 giây 950C: 45 giây Bắt cặp 600C: 30 giây 570C: 90 giây 540C: 30 giây 520C: 30 giây Kéo dài 720C: 1 phút 720C: 1 phút 720C: 1 phút 720C: 45 giây Kết thúc 720C: 10 phút 720C: 10 phút 720C: 10 phút 720C: 7 phút
Số chu kỳ 35 35 35 35
Tài liệu tham
khảo [47,58] [38] [45] [45]
Thời gian điện di trên agarose 1.5%
30 phút 40 phút 40 phút 30 phút
Sản phẩm PCR được giữ ở 40C.
c. Điện di: Sản phẩm PCR được phát hiện bằng cách điện di trên gel agarose 1.5%, nhuộm ethidium bromide. Điện di bằng máy điện di To Yo Ro, nguồn điện 100V, dung dịch đệm cho điện di là TBE 0,5X.
d. Đọc kết quả:
Đọc kết quả điện di bằng máy chụp gel Sygene (Mỹ) và phân tích kết quả.