ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trên đối tượng là cây đậu cô ve A được trồng phổ biến ở nước ta. Hạt giống được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu và thực nghiệm đậu đỗ - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.

2.2. Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm trồng cây trong chậu: Chậu có kích thước 3545 cm, mỗi chậu gieo 6 hạt. Hạt được trồng trong các chậu thí nghiệm. Chia các chậu thí nghiệm làm 4 công thức thí nghiệm (CTTN): lô đối chứng (ĐC), lô gây hạn ở thời kỳ cây non, lô gây hạn ở thời kỳ ra hoa, lô gây hạn ở thời kỳ quả non. Mỗi CTTN được nhắc lại 7 lần với tổng số chậu phải trồng là 124 chậu.

Đảm bảo chế độ chăm sóc đồng đều đến ngày thứ 14-15 sau khi gieo, lá mầm rụng đi, cây thực sự bắt đầu cuộc sống tự dưỡng (khi cây có 3-5 lá thật) sau đó tiến hành gây hạn.

Phương pháp gây hạn: lô đối chứng vẫn được tưới nước bình thường, lô thí nghiệm không được tưới nước và cách ly với nước mưa cho đến khi đôi lá dưới cùng của cây có triệu chứng héo. Trong quá trình gây hạn tiến hành thu mẫu (lấy lá thứ 3 từ đỉnh sinh trưởng) vào buổi sáng 8h. Đây là lá trưởng thành của cây thực hiện đầy đủ chức năng quang hợp, sinh tổng hợp và chuyển hóa các chất cho cây. Sau đó xác định hàm lượng proline.

Ở giai đoạn chuẩn bị ra hoa, tiến hành gây hạn và xác định chỉ tiêu tương tự như giai đoạn cây non.

Khi quả hình thành hạt non, lấy số liệu về chiều dài quả và số quả trên cây. Khi quả chín, thu hoạch để lấy số liệu khối lượng 100 hạt và xác định hàm lượng nitơ tổng số trong hạt.

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2 đến tháng 5 năm 2009

Địa điểm nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ và khu nhà lưới thí nghiệm thuộc khoa Sinh – KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.

2.4. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu 2.4.1. Hàm lượng proline

* Lý thuyết của máy đo quang phổ (Spectrophotometer)

Những hợp chất có màu là do trong phân tử có chứa các nhóm mang màu là các liên kết đôi, liên kết ba và nhóm trợ màu là các hệ liên hợp

Theo lý thuyết MO-Huckel (thuyết obital phân tử): liên kết trong nhóm mang màu là kết quả của sự phân bố các electron vào các MO. Phân tử sẽ hấp thụ photon có năng lượng Ep chuyển lên trạng thái kích thích.

Ep =



hc = E= E* - Ecb Trong đó, E* : năng lượng ở trạng thái kích thích

Ecb: năng lượng ở trạng thái cơ bản của phân tử H: Hằng số Planck

C: vận tốc ánh sáng

: bước sóng của ánh sáng kích thích

Năng lượng kích thích phụ thuộc vào cấu trúc electron của phân tử hay phân tử chỉ hấp thụ tia sáng có bước sóng nhất định, đặc trưng cho phân tử. Khi đưa một dải photon trong vùng tử ngoại khả kiến UV (ultraviolet-visible spectre, UV-VIS) qua dung dịch chiết, sẽ cho ta một phổ UV-VIS đặc trưng cho cấu trúc phân tử. Do đó có thể sử dụng phổ UV-VIS để nghiên cứu cấu trúc phân tử hữu cơ nói chung và các hợp chất màu nói riêng. Dựa vào phổ UV của phân tử ta có thể biết bước sóng hấp thụ đặc trưng của của phân tử đó, tươnng ứng với các

pick trên phổ UV. Theo những nghiên cứu cho thấy phân tử proline hấp thụ tia sáng có bước sóng 520nm.

Nguyên tắc hoạt động của máy đo quang phổ spectrophotometer

Nguồn sáng - Bộ tách sóng - Cuvet mẫu - Bộ phân tích - Bộ phận in Mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch

Dựa vào định luật Lambert – Bert:

D = log

I

Io = log

T

1 = C d

Trong đó, D: mật độ quang đo ở bước sóng  T: độ truyền qua, có giá trị từ 0-100%

C: nồng độ dung dịch, mol/l

I, Io: cường độ bức xạ trước và sau khi ra khỏi dung dịch

: hệ số hấp thụ

d: chiều dày lớp dung dịch hay chiều dày cuvet

Như vậy, với d,  không đổi thì giá trị của D phụ thuộc vào nồng độ C của dung dịch và bước sóng  khi đó D = f (), D = f(C)

* Xác định hàm lượng proline theo phương pháp của Bates và cộng sự (1973) và cải tiến của Đinh Thị Phòng [22]

Lấy mỗi mẫu 0,5 g nghiền kỹ với 5ml dung dịch axit sulfosalicylic.

Thêm 5ml dung dịch axit sulfosalicylic, trộn đều, tráng cối chày bằng 5ml dung dịch axit sulfosalicylic nữa trộn đều toàn bộ hỗn hợp.

Quay ly tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút, thu lấy dịch trong.

Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình (hoặc lọ thủy tinh penixilin, ống nghiệm…), thêm 2ml axit axetic và 2ml dung dịch nynhydrin-axit (dung dịch này gồm 30ml

axit axetic + 1,25g nynhydrin), đậy kín vì axit axetic bay hơi mạnh, ủ trong nước nóng 100oC trong 1 giờ, sau đó ủ trong khay đá 5 phút.

Bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều, lấy phần dịch màu hồng ở trên đem đo mật độ quang học (OD – Optical density) ở bước sóng  = 520nm trên máy quang phổ UV - Visible – Spectrophotometer, UV- 2450 do hãng SHIMADZU – Mỹ sản xuất.

Hàm lượng axit amin proline được tính theo công thức sau:

Y = 1,408 X + 0,014 R2 = 0,9991

(Công thức được suy ra từ việc lập đường chuẩn proline) Trong đó:

Y: hàm lượng proline được tính bằng mg/l

X: giá trị mật độ quang học OD đo được ở bước sóng 520 nm.

Quy đổi ra hàm lượng mg/g R2: Là hệ số tương quan.

Y x V A =

P x 1000

A: Hàm lượng Proline (mg/g) P: Khối lượng mẫu (g)

V: Thể tích dịch proline chiết được

Tất cả các L-axit amin đều phản ứng màu với nynhydrin tạo thành hợp chất màu xanh tím, riêng Iminoaxit như proline tạo thành màu vàng với cơ chế phản ứng phức tạp. Hợp chất màu vàng có cực đại hấp thụ ở bước sóng = 520nm.

2.4.2. Các yếu tố cấu thành năng suất

Trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số yếu tố cấu thành năng suất là: chiều dài quả; số quả/cây; trọng lượng 100 hạt. Bằng cách đo và đếm trực tiếp, cân trên cân điện Satorius. Mỗi công thức nhắc lại 7 lần.

2.4.3. Hàm lượng nitơ tổng số của hạt

Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Microkjeldahl trên máy cất đạm tự động với hệ thống chưng cất UDK 142 và bộ công phá mẫu DK6 của hãng VELP-Italia. Hàm lượng nitơ tổng số được tính theo hàm lượng HCl dùng để chuẩn độ đơn vị là mg/g (1ml HCl 0,2N = 2,803 mg N – NH4 có trong mẫu)

2.5. Phương pháp xử lý số liệu thống kê

Các kết quả nghiên cứu được xử lý và đánh giá theo phương pháp toán thống kê sinh học thông qua các tham số sau:

=

n

X ;  2 =

1 )

( 2





 n

X

X (nếu n < 30); 2=

n X X )2 ( 

 (nếu n 30)

2

  ; cv =

X 100



; m =

n

 ; m% =

X m 100

md = (m12 m22); td =

md

d ; d =XĐC- XTN

Trong đó:

X : Giá trị trung bình số học m% : Độ chính xác của thí nghiệm

n : Số lần nhắc lại md : Sai số của hiệu các trung bình số học

 : Độ lệch chuẩn m : Sai số của trung bình số học cv : Hệ số biến động td : Tiêu chuẩn độ tin của hiệu

Tiêu chuẩn độ tin của hiệu (td) được so với bảng tiêu chuẩn Student với số bậc tự do: n1 + n2 – 2 (Trong đó: n1: số lần nhắc lại ở công thức thí nghiệm, n2: số lần nhắc lại ở công thức đối chứng). Sự sai khác giữa các trị số trung bình chỉ có ý nghĩa khi td lớn hơn hoặc bằng giá trị tương ứng với mức xác suất 0,95.

Các tính toán được thực hiện trên cơ sở những ứng dụng của phần mềm Microsof Excel. Trong mỗi bảng số liệu, số liệu trong mỗi cột kèm theo các chữ cái giống nhau thể hiện sự sai khác không có ý nghĩa thống kê; các chữ cái khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy α = 0,05. Số liệu so sánh giữa thí nghiệm với đối chứng kèm theo dấu * thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy α = 0,05.

Chương 3