III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
III.2. Khảo sát insilico xác định bộ mồi khuếch đại trình tự gen LDLR
Dựa vào dữ liệu trên NCBI, chúng tôi thu thập bộ dữ liệu trình tự gen LDLR nằm ở vị trí từ 11.089.362 đến 11.133.830 trên nhiễm sắc sô 19 với mã số truy cập NC_000019.10. Đồng thời, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tương đồng của trình tự gen LDLR NC_000019.10 (11.089.362-11.133.830) với các trình tự có trên ngân hàng gen của NCBI bằng công cụ sắp gióng cột Blastn (NCBI).
Kết quả phân tích cho thấy trình tự gen LDLR NC_000019.10(11.089.362- 11.133.830 ) phù hợp là trình tự tham chiếu trong nội dung khảo sát trên máy tính để chọn lọc bộ mồi cho phương pháp PCR phân tích tính chất đột biến trên trình tự gen LDLR của DNA một số mẫu bệnh phẩm trong nội dung nghiên cứu thực nghiệm.
26
Hình 3.4 Kết quả sắp gióng cột trình tự gen LDLR bằng công cụ Blastn III.2.2. Bộ mồi khuếch đại trình tự exon 4 gen LDLR
Dựa trên một số công trình nghiên cứu khoa học của Azian và cộng sự (2006), Ashavaid và cộng sự (2000), Chang và cộng sự (2003), Chater và cộng sự (2006), Yang và cộng sự (2007), Khan và cộng sự (2011) chúng tôi thu thập bộ mồi khuếch đại trình tự exon 4 gen LDLR được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4 Các bộ mồi khuếch đại vùng trình tự exon 4 thuộc gen LDLR
TÊN MỒI TRÌNH TỰ MỒI (5’-3’)
CHIỀU DÀI MỒI
(bp)
CHIỀU DÀI SẢN
PHẨM (bp)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
LDLR_F1 CCCCAAGACTGTCTCCCAGGACGA 24
412 Ashavaid, 2000 LDLR_R1 ACGCCCCGCCCCCACCCTGCCCCGC 25
LDLR_F2 ACCTGTGGTCCCGCCAGC 18
1395 Azian, 2006
LDLR_R2 AGCAGCAAGGCACAGAGAATGG 22
LDLR_F3 ACTGCGGCAGCGTCCCCGGC 20
518 Azian, 2006
LDLR_R3 CCAGGGACAGGTGATAGGACG 21
LDLR_F4 TGGTCTCGGCCATCCATCCCTGCAG 25
439 Chang, 2003 LDLR_R4 ACGCCCCGCCCCCACCCTGCCCCGC 25
LDLR_F5 ATGAGGAAACTGAGGCACCGAG 22
443 Chater,2006
LDLR_R5 TGTCCCCTTGGAACACGTAAAG 22
LDLR_F6 TCCAGTGCAACAGCTCCACC 20
341 Chater, 2006
LDLR_R6 GTTGGAAATCCACTTCGGCAC 21
LDLR_F7 GACTTCACACGGTGATGGTG 20
308 Yang, 2007
LDLR_R7 CCCCTTGGAACACGTAAAGA 20
LDLR_F8 AAGTGCATCTCTCGGCAGTT 20
387 Yang, 2007
LDLR_R8 CCAGGGACAGGTGATAGGAC 20
LDLR_F9 CCCCAAGACTGTCTCCCAGGACGA 24
412 Khan, 2011 LDLR_R9 ACGCCCCGCCCCCACCCTGCCCCGC 25
LDLR_F10 ACTGCGGCAGCGTCCCCGGC 20
527 Jensen, 1996
LDLR_R10 TGGGGGAGCCCAGGGACAGG 20
27
Dựa trên hệ thống dữ liệu LOVD và NCBI, và công cụ Blast chúng tôi ghi nhận vị trí vùng trình tự exon 4 thuộc gen LDLR trên vùng trình tự NC_000019.10 là 11.105.220– 11.105.600.
Sau đó, chúng tôi xác định vị trí hoạt động của các cặp mồi trên trình tự tham chiếu NC_000019.10 bằng công cụ BLAST và Annhyb, kết quả trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5 Kết quả phân tích độ tương đồng của các bộ mồi với trình tự tham chiếu bằng công cụ Blastn
Tên mồi
Điểm số tương
đồng
% Độ tương đồng
Độ bao phủ
Vị trí tương đồng (NC_000019.10)
Giá trị E- value
Trạng thái chuỗi trình
tự
“Query”/“Su bject”
LDLR_F1 30,2 100% 100% 18970.529–18.970.543 0,42 +/+
LDLR_R1 38,2 100% 100% 11.105.632-11.105.614 0,002 +/- LDLR_F2 36,2 100% 100% 11.105.345-11.105.362 0,003 +/+
LDLR_R2 44,1 100% 100% 11.106.739-11.106.718 2e-05 +/- LDLR_F3 40,1 100% 100% 11.105.133-11.105.152 3e-04 +/+
LDLR_R3 42,1 100% 100% 11.105.650-11.105.630 9e-05 +/- LDLR_F4 36,2 100% 100% 11.105.194-11.105.219 0,008 +/+
LDLR_R4 38,2 100% 100% 11.105.632-11.105.614 0,002 +/- LDLR_F5 44,1 100% 100% 11.105.044-11.105.065 2e-05 +/+
LDLR_R5 44,1 100% 100% 11.105.486-11.105.465 2e-05 +/- LDLR_F6 40,1 100% 100% 11.105.364-11.105.383 3e-04 +/+
LDLR_R6 42,1 100% 100% 11.105.704-11.105.684 9e-05 +/- LDLR_F7 40,1 100% 100% 11.105.176-11.105.195 3e-04 +/+
LDLR_R7 40,1 100% 100% 11.105.483-11.105.464 3e-04 +/- LDLR_F8 40,1 100% 100% 11.105.264-11.105.283 3e-04 +/+
LDLR_R8 40,1 100% 100% 11.105.650-11.105.631 3e-04 +/- LDLR_F9 30,2 100% 100% 18.970.529-18.970.543 0,42 +/+
LDLR_R9 38,2 100% 100% 11.105.632-11.105.614 0,002 +/- LDLR_F10 40,1 100% 100% 11.105.133-11.105.152 3e-04 +/+
LDLR_R10 40,1 100% 100% 11.105.659-11.105.640 3e-04 +/- Chú thích: “Query” là các trình tự mồi ở trạng thái mạch dương (+); “Subject” là các trình tự tương đồng với trình tự mồi, được chọn lọc bởi công cụ BLAST và trạng thái mạch dương (+) hoặc mạch âm (-).
Đồng thời, chúng tôi sử dụng công cụ Oligo Analyzer IDT để xác định các thông số vật lý của bộ mồi nêu trên như: chiều dài, % GC, nhiệt độ nóng chảy (Tm), chiều dài sản phẩm (bp) kết quả được trình bày ở bảng 3.6.
28
Bảng 3.6 Thông số vật lý của các bộ mồi khuếch đại vùng trình tự exon 4 thuộc gen LDLR
Tên mồi xuôi Chiều dài mồi (bp)
Tm (°C)
GC (%)
Tên mồi ngược
Chiều dài mồi
(bp)
Tm (°C)
GC (%)
Chiều dài sản
phẩm (bp)
LDLR_F1 24 64 62,5 LDLR_R1 25 79.4 88 412
LDLR_F2 18 63,5 72,2 LDLR_R2 22 60,1 54,5 1395
LDLR_F3 20 70,7 80 LDLR_R3 21 59,1 61,9 518
LDLR_F4 25 66,5 64 LDLR_R4 25 79,4 88 439
LDLR_F5 22 59,1 54,5 LDLR_R5 22 57,1 50 443
LDLR_F6 20 60,2 60 LDLR_R6 21 56,8 52,4 341
LDLR_F7 20 55,9 55 LDLR_R7 20 54,7 50 308
LDLR_F8 20 56,8 50 LDLR_R8 20 56,7 60 387
LDLR_F9 24 64 62,5 LDLR_R9 25 79,4 88 412
LDLR_F10 20 70,7 80 LDLR_R10 20 66,7 75 527
Dựa trên một số tiêu chí thiết kế mồi cho phương pháp PCR trong tài liệu Giáo trình Ứng dụng tin học trong Công nghệ sinh học (Lê Huyền Ái Thúy, 2016) và công cụ trực tuyến Oligo analyzer IDT: chiều dài sản phẩm khuếch đại trong khoảng 100 - 600 bp; tỷ lệ %GC khoảng 50 - 60%; nhiệt độ nóng chảy (Tm): từ 50°C - 65°C, nhiệt độ Tm chênh lệch giữa hai mồi (∆Tm) < 5°C; giá trị năng lượng hình thành các cấu trúc thứ cấp (cấu trúc kẹp tóc, homo dimer, hetero dimer), giá trị ∆G (Kcal/mol) phù hợp trong khoảng 9> ∆G > -9 Kcal/mol.
Chúng tôi ghi nhận cặp mồi LDLR_F5 – LDLR_R5 là cặp mồi phù hợp cho quy trình PCR khuếch đại vùng trình tự exon 4 gen LDLR đối với một số mẫu bệnh phẩm máu của bệnh nhân tăng cholesterol máu ở Việt Nam với chiều dài sản phẩm dự kiến là 443 bp.
Bảng 3.7. Kết quả phân tích thông số vật lí của bộ mồi LDLR_F5 và LDLR_R5 khuếch đại vùng trình tự exon4 gen LDLR
Tên mồi
Chiều dài (bp)
%GC (%)
Tm (°C)
∆G Hairpin(kcal/mol)
∆G Self- dimer(kcal/mol)
∆G Hetero -dimer (kcal/mol)
LDLR_F5 22 54,5 59,1 -0,78 -3,61
-4,67
LDLR_R5 22 50 57,1 -0,5 -6,3
29 Chú thích:
− Tm là nhiệt độ nóng chảy.
− ∆G Hairpin là mức năng lượng hình thành cấu trúc kẹp tóc.
− ∆G Self-dimer là mức năng lượng hình thành cấu trúc tự bắt cặp.
− ∆G Hetero -dimer là mức liên kết hình thành cấu trúc dị bắt cặp.