III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
III.1. Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp tính chất đột biến trên gen LDLR
III.1.1. Khai thác dữ liệu
Dựa vào cơ sở dữ liệu trực tuyến của NCBI, Google, Google Scholar,… và cập nhật đến 5/2019, chúng tôi thu thập được 192 công trình nghiên cứu khoa học thuộc hướng nghiên cứu về tính chất đột biến điểm trên gen LDLR và bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH) trên thế giới. Từ đó, chúng tôi xác định tiêu chí trích xuất dữ liệu cho phân tích tổng hợp như nội dung II.2.2.
- Vấn đề cần nghiên cứu: tính chất đột biến điểm trên gen LDLR ở những bệnh nhân bệnh tăng cholesterol máu.
- Thông tin nghiên cứu: phương pháp nghiên cứu, tính chất đột biến điểm trên gen LDLR, quần thể người bệnh, các thông tin bệnh học của bệnh lý cao cholesterol máu, số lượng cụ thể của bộ mẫu có tính chất đột biến điểm trên gen LDLR,...
Chúng tôi chọn lọc bộ dữ liệu để thực hiện phân tích tổng hợp, bao gồm 38 công trình nghiên cứu khoa học thuộc hướng nghiên cứu đoàn hệ (Cohort) về tính chất đột biến điểm trên gen LDLR và bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH) trên thế giới. Trong quá trình phân tích, chúng tôi tập trung xác định chỉ số (Proportion-PR%) phản ánh tỷ lệ/tần suất tính chất đột biến điểm trên gen LDLR và bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình trên tổng số 8315 mẫu bệnh phẩm bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (Hình 3.1 và bảng 3.1)
18
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp tính chất đột biến điểm trên gen LDLR
Tổng số công trình nghiên cứu tổng quan
(n = 107)
Tổng số công trình nghiên cứu (n = 192)
Tổng số công trình nghiên cứu ở dạng tóm tắt
(n = 77)
Tổng số công trình nghiên cứu toàn văn thích hợp
(n = 52)
Các nghiên cứu phân tích tổng hợp
(n = 38)
Tổng sô công trình nghiên cứu bị trùng lắp
(n = 85)
Các nghiên cứu không liên quan đến bài nghiên cứu
(n = 30)
Tổng công trình nghiên cứu không đáp ứng theo tiêu chí (Khác gen, phương pháp,..)
(n = 25)
Tổng công trình nghiên cứu không đáp ứng theo tiêu chí (Không công bố tỷ lệ đột biến)
(n = 14)
19
Bảng 3.1 Bộ dữ liệu công trình nghiên cứu đoàn hệ đột biến trên gen LDLR
Công trình nghiên cứu
Quốc gia
Châu lục Phương pháp
Bệnh FH
Cỡ mẫu
Số mẫu đột biến ArulJothi, 2018 Ấn độ Châu Á Phương pháp khác 70 20 López, 2018 Colombia Châu Âu PCR giải trình tự 24 5 Durst, 2017 Israel Châu Á PCR giải trình tự 67 16 Gabčová, 2017 Slovakia Châu Âu PCR giải trình tự 292 75 Xiang,2017 Trung Quốc Châu Á Phương pháp khác 219 158 Du, 2016 Trung Quốc Châu Á PCR giải trình tự 11 11 Pandey, 2016 Anh Châu Âu Phương pháp khác 12 5 Wintjens, 2016 Pháp Châu Âu Phương pháp khác 116 91 Fan, 2015 Trung Quốc Châu Á PCR giải trình tự 20 13 Sharifi, 2015 Ba Lan Châu Âu Phương pháp khác 161 57 Han, 2015 Hàn Quốc Châu Á PCR giải trình tự 161 57 Mollaki, 2014 Hy Lạp Châu Âu PCR giải trình tự 561 299 Jannes, 2014 Brazil Châu Mỹ Phương pháp khác 248 125 Pecin ,2012 Croatia Châu Âu PCR giải trình tự 8 6 Tychi, 2012 Cộng hoà Séc Châu Âu PCR giải trình tự 2239 535 Diakou, 2011 Hy Lạp Châu Âu PCR giải trình tự 254 169 Futema, 2011 Mỹ Châu Mỹ PCR giải trình tự 48 14 Vaca, 2011 Mexico Châu Âu Phương pháp khác 62 24 Romano, 2010 Ý Châu Âu PCR giải trình tự 56 43 Yang, 2007 Đài Loan Châu Á PCR giải trình tự 30 14 Azian, 2006 Malaysia Châu Á Phương pháp khác 39 4 Chater, 2006 Ma-rốc Châu Phi PCR giải trình tự 24 19 Charng, 2006 Đài Loan Châu Á PCR giải trình tự 24 19 Tosi, 2006 Anh Châu Âu Phương pháp khác 200 177 Dedoussis, 2004 Đức Châu Âu Phương pháp khác 200 69 Mozas, 2004 Tây Ban Nha Châu Âu Phương pháp khác 476 329 El Messal, 2003 Ma-rốc Châu Phi PCR giải trình tự 8 8 Yu, 2002 Nhật Bản Châu Á PCR giải trình tự 200 125 Salazar, 2002 Brazil Châu Mỹ Phương pháp khác 35 22 Bochmann, 2001 Đức Châu  PCR giải trình tự 31 19 García, 2001 Tây Ban Nha Châu Âu Phương pháp khác 113 83 Nauck, 2001 Đức Châu Âu Phương pháp khác 100 56 Lombardi, 2000 Ba Lan Châu Âu PCR giải trình tự 1223 358 Haddad, 1999 Utah Châu Mỹ Phương pháp khác 47 19 Leren, 1997 Na Uy Châu Âu PCR giải trình tự 742 476 Webb, 1996 Anh Châu Âu PCR giải trình tự 15 15 Lombardi, 1995 Hà Lan Châu Âu PCR giải trình tự 32 28 Maruyama, 1995 Nhật Bản Châu Á Phương pháp khác 120 38
20
III.1.2. Phân tích tổng hợp
Xét về tính bất đồng nhất của bộ dữ liệu, chỉ số I2 = 97,74% (P < 0,0001) thể hiện rõ tính bất đồng nhất về tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR trong 38 công trình nghiên cứu khoa học nêu trên. Do đó, chỉ số Proportion được xác định theo mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model-R), kết quả thể hiện ở Hình 3.2, và Bảng 3.2. Chúng tôi ghi nhận chỉ số Proportion xấp xỉ 52,474 (95%CI:
44,738-60,151) theo mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên, kết quả này phản ánh tỷ lệ xuất hiện tính chất đột biến trên gen LDLR ở các bệnh nhân FH là 52,474%.
Đồng thời, chúng tôi xuất đồ thị Funnel plot để biểu thị tính chất thiên vị của bộ dữ liệu đưa vào phân tích tổng hợp. Kết quả này thể hiện ở hình 3.3.
Song song đó, tính chất bất đồng nhất của bộ dữ liệu có thể phụ thuộc vào yếu tố phương pháp phân tích đột biến, quần thể người bệnh. Vì vậy, chúng tôi xác định chỉ số Proportion theo một số phân hạng: phương pháp, chủng tộc, loại bệnh, phả hệ, tính chất đột biến trên exon 4 thuộc gen LDLR để phản ánh chi tiết hơn sự tương quan giữa tính chất đột biến trên gen LDLR và bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình.
21
Hình 3.2 Đồ thị “Forest plot” biểu thị tỷ lệ đột biến gen LDLR trên bộ mẫu bệnh phẩm cao cholesterol
22
Hình 3.3 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính bất đồng nhất của bộ dữ liệu đoàn hệ khi phân tích tỷ lệ đột biến gen LDLR trên bộ mẫu bệnh phẩm cao
cholesterol
Tiếp theo, chúng tôi tiến hành làm rõ chỉ số Proportion tương ứng với tỷ lệ xuất hiện tính chất đột biến trên gen LDLR ở các bệnh nhân FH, trên một số phân hạng liên quan đến thông tin của các công bố khoa học: phương pháp sinh học phân tử phân tích đột biến, thông tin bệnh học (yếu tố chủng tộc, phả hệ, dạng bệnh lý,…).
Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả phân tích sự tương quan giữa tỷ lệ đột biến trên gen LDLR và bệnh FH từ các công trình nghiên cứu khoa học đoàn hệ
Phân tích tính bất đồng nhất Chỉ số N Chỉ số “Proportion” (95% CI) Mô
hình PH I2 (%) Tổng cộng 38 52,474 (44,738-60,151) R < 0,0001 98,31 Phương pháp
PCR - Giải trình
tự 19 59,753 (50,181-68,964) R < 0,0001 92,93
Khác 19 45,355 (35,290-55,616) R < 0,0001 98,35
Chủng tộc
Người Châu Á 11 41,440 (27,304-56,336) R < 0,0001 95,43 Người Châu Âu 21 57,290 (46,570-67,674) R < 0,0001 98,51 Người Châu Mỹ 4 48,256 (33,153-63,524) R 0,0001 85,85 Người Châu Phi 2 76,583 (58,953-89,334) F 0,7366 0,00 Yếu tố phả hệ
Familly 7 38,084 (25,398-51,657) R < 0,0001 92,98
Proband 31 57,084 (48,190-65,754) R < 0,0001 97,90 Yếu tố loại bệnh
FH 35 52,193 (44,166-60,163) R < 0,0001 97,84
ADH 3 55,582 (27,629-81,735) R < 0,0001 93,65
23 Chú thích: R: Random effects model (mô hình phân tích tổng hợp ngẫu nhiên); F: Fixed effects model (mô hình phân tích tổng hợp bất biến)
Xét về phân hạng phương pháp
Chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gen LDLR trong nhóm bệnh nhân có biểu hiện nồng độ cholesterol trong máu cao bất thường được phân tích bằng phương pháp PCR-giải trình tự cao hơn các phương pháp sinh học phân tử khác lần lượt là 59,753 (95% CI: 50,181-68,964; P < 0,0001; mô hình R) và 45,355 (95% CI: 35,290-55,616; P < 0,0001; mô hình R). Lý giải cho việc phân chia các nhóm phương pháp: (1) Hiện nay có rất nhiều phương pháp sinh học phân tử xác định tính chất đột biến trên gen người: NGS (Next Generation Sequencing), HRM (High Resolution Melt) nhưng phương pháp PCR –giải trình tự vẫn được xem là phương pháp (Bevan et al., 1992) cho phép xác định các dạng đột biến đã công bố hoặc chưa công bố trên trình tự mục tiêu có tính chất đột biến phức tạp; (2) Nhóm nghiên cứu xác định tính phù hợp của phương pháp PCR-giải trình tự để đưa vào nội dung nghiên cứu và đây là phương pháp phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Xét về phân hạng chủng tộc
Chỉ số “Proportion” phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR thuộc nhóm bệnh nhân ở Châu Âu là 57,290 (95% CI: 46,570-67,674; P < 0,0001; mô hình R), Châu Á là 41,440 (95% CI: 27,304-56,336; P < 0,0001; mô hình R), Châu Mỹ là 48,256 (95% CI: 33,153-63,524; P < 0,0001; mô hình R), Châu Phi là 76,583 (95% CI: 58,953-89,334; P < 0,0001; mô hình F) (Bảng 3.4). Xét ở người Châu Á, kết quả phân tích đã phản ánh được tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR của nhóm bệnh nhân ở Châu Á là 41,440 (95% CI: 27,304-56,336; P < 0,0001; mô hình R). Đây là dữ kiện cho thấy nguy cơ mắc bệnh FH ở người châu Á là rất lớn cũng như tính chất đặc điểm phân tử quyết định sự tiến triển thành bệnh FH ở người châu Á là do đột biến điểm trên gen LDLR như đã đề cập ở các kết quả trên.
Xét về phân hạng phả hệ: “Proband” và “Familly”
Chỉ số “Proportion” phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR thuộc nhóm bệnh nhân có tiền sử bệnh gia đình (“Familly”) và nhóm bệnh nhân riêng lẻ
24
(“Proband”), lần lượt là 38,084 (95% CI: 25,398-51,657; P < 0,0001; mô hình R) và 57,084 (95% CI: 48,190-65,754; P < 0,0001; mô hình R), chi tiết thể hiện ở Bảng 3.4.
Kết quả phân tích biểu thị tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR giữa nhóm
“Proband” và “Familly” gần như bằng nhau, phản ánh tính chất đột biến điểm trên gen LDLR là nguyên nhân chính gây ra bệnh lý FH, không chỉ ở bệnh nhân có tiền sử bệnh gia đình mà còn các bệnh nhân riêng lẻ. Nói cách khác, khi các bệnh nhân riêng lẻ được chẩn đoán mắc bệnh FH thì “việc thiết thực cần phải làm” là tầm soát, sàng lọc trên những người thân của bệnh nhân để làm tăng hiệu quả của việc dự đoán, tiên lượng bệnh và điều trị bệnh cho bệnh nhân và người thân, làm giảm nguy cơ mắc các bệnh lý tim mạch…
Xét về phân hạng loại bệnh
Chỉ số “Proportion” phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR thuộc nhóm bệnh nhân bệnh FH là 52,193 (95% CI: 44,166-60,163; P < 0,0001; mô hình R), ở nhóm bệnh nhân bệnh ADH là 55,582 (95% CI: 27,629-81,735; P < 0,0001;
mô hình R).
Phân tích tổng hợp tỷ lệ xuất hiện tính chất đột biến trên một số exon thuộc gen LDLR
Dựa vào 38 công trình nghiên cứu đoàn hệ và tiêu chí trích xuất dữ liệu, chúng tôi chọn lọc 31 công trình nghiên cứu xác định chỉ số Proportion về tính chất xuất hiện đột biến trên exon 4 thuộc gen LDLR, kết quả được trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3 Kết quả phân tích tính chất đột biến một số exon gen LDLR
Phân tích ảnh hưởng Tính bất đồng nhất Exon Chỉ số Proportion (95% CI) Mô hình PH I2(%)
1 4,973 (2,334-8,532) R 0,0098 64,42
2 5,190 (3,149-7,705) R 0,0049 54,39
3 7,984 (4,980-11,621) R <0,0001 69,77
4 19,514 (15,741-23,587) R <0,0001 61,49
5 8,134 (4,575-12,600) R <0,0001 77,96
6 7,145 (4,615-10,174) R 0,0097 52,14
7 6,764 (5,316-8,462) F 0,0655 36,64
8 4,786 (3,600-6,220) R 0,0094 48,58
9 9,242 (7,753-10,909) F 0,1715 20,45
10 6,155 (4,867-7,662) R 0,0302 38,92
11 5,320 (3,926-7,026) F 0,3071 13,35
12 10,470 (6,436-15,346) R <0,0001 74,44
25
13 3,769 (2,668-5,157) F 0,2891 15,40
14 9,072 (5,537-13,371) R <0,0001 75,36
15 5,902 (2,911-9,854) R 0,0055 61,42
16 2,457 (1,045-4,732) F 0,2590 23,29
17 7,225 (3,659-11,873) R <0,0001 81.37
Kết quả phản ánh các exon có giá trị chỉ số Proportion lớn nhất là exon 4. Chúng tôi cũng dựa vào nguồn dữ liệu LOVD, exon 4 đã được ghi nhận có xuất hiện nhiều dạng đột biến có liên quan đến bệnh FH. Cụ thể trong kết quả nghiên cứu của chuyên đền khóa luận này, chúng tôi xác định chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ đột biến xuất hiện trên exon 4 thuộc gen LDLR là 19,154 (95% CI: 15,741-23,587; P <
0,0001; mô hình R) là cao nhất so với chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các exon khác thuộc gen LDLR. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.3 và Hình 3.3. Vì vậy, trong nội dung nghiên cứu này chúng tôi tiếp tục thực hiện nội dung phân tích tính chất đột biến trên gen LDLR với trình tự mục tiêu là exon 4 thuộc gen LDLR.
III.2. Khảo sát insilico xác định bộ mồi khuếch đại trình tự gen LDLR