Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2 Xác định các chủng vi khuẩn Vibrio độc lực
Trong thời gian thực hiện đề tài chúng tôi đã tiến hành tổng cộng 3 thí nghiệm gây nhiễm vi khuẩn: 02 thí nghiệm đối với loài vi khuẩn V.
paraheamolyticus thu được tại Nam Định ký hiệu là V. paraheamolyticus 13- 041; và 01 thí nghiệm đối với chủng V. paraheamolyticus thu được từ Hải phòng năm 2012 ký hiệu là V. paraheamolyticus 12-020.
* Kết quả thí nghiệm 1:
- CTVK 108: Tỷ lệ chết 100% trong thời gian 14h - CTVK 107: Tỷ lệ chết 100% trong thời gian 24h
- CTVK 106: bắt đầu chết sau 13h, và chết rải rác vào những ngày tiếp theo cho đến khi thu mẫu định kỳ 21 ngày (tỷ lệ chết trung bình 83%).
- Tỷ lệ tái phân lập lại vi khuẩn 0% (0/17 mẫu).
- Tỷ lệ mẫu được xác định là hoại tử gan tụy cấp theo phương pháp mô bệnh học là: 0% (0/45 mẫu).
Số liệu chi tiết được thể hiện ở bảng 3.3:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41
Bảng 3.3: Kết quả tái phân lập vi khuẩn và phân tích mô học thí nghiệm 1
Loại mẫu
Công thức TN
Vi khuẩn Xác định ANHPD theo PP Mô học Số
lượng mẫu
Tái phân lập VK
Số lượng
mẫu
Số mẫu (+)
Định kỳ 7 ngày
ĐC 17 0 18 0
CTVK106-06 6 0 6 0
CTVK106-12 3 0 3 0
CTVK106-24 4 0 3 0
Tổng 30 0 30 0
Định kỳ 14 ngày
ĐC 18 0 18 0
CTVK106-06 5 0 5 0
CTVK106-12 3 0 3 0
CTVK106-24 3 0 1 0
Tổng 29 0 27 0
Định kỳ 21 ngày
ĐC 8 0 8 0
CTVK106-06 4 0 10 0
Tổng 12 0 18 0
Tổng cộng 71 0 75 0
Theo bảng 3.3 thì không có mẫu nào dương tính với AHPND trong số 75 mẫu xét nghiệm bằng phương pháp mô bệnh học. Tuy nhiên, chúng tôi nghi ngờ có thể do tôm chết do bị sốc do nồng độ vi khuẩn quá cao. Vì vậy, để khẳng định rõ tác nhân gây bệnh, chúng tôi tiếp tục tiến hành lặp lại thí nghiệm 1 bằng thí nghiệm 2 nhưng ở các nồng độ thấp hơn (104, 105, 106 (cfu/ml)) và thời gian ngâm vi khuẩn là ngắn hơn (1h, 3h, 6h).
* Kết quả thí nhiệm 2:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42
- Tỷ lệ chết trung bình ở nồng độ 106 là 71%
- Tỷ lệ chết trung bình ở nồng độ 105 là 21%
- Tỷ lệ chết trung bình ở nồng độ 104 là 9%.
- Tỷ lệ tái phân lập lại vi khuẩn 0%.
- Tỷ lệ mẫu được xác định là hoại tử gan tụy cấp theo phương pháp mô bệnh học là: 0%
Số liệu chi tiết được thể hiện ở bảng 3.4:
Bảng 3.4: Kết quả tái phân lập vi khuẩn và phân tích mô học thí nghiệm 2
Loại mẫu
Công thức TN
Vi khuẩn Xác định ANHPD theo PP Mô học Số
lượng mẫu
Tái phân lập VK lây
nhiễm
Số lượng
mẫu
Số mẫu (+)
Định kỳ 7 ngày
ĐC 9 0 17 0
CTVK106 8 0 11 0
CTVK105 9 0 16 0
CTVK104 9 0 17 0
Tổng 35 0 30 0
Định kỳ 14 ngày
ĐC 9 0 18 0
CTVK106 9 0 9 0
CTVK105 9 0 17 0
CTVK104 9 0 18 0
Tổng 36 0 62 0
Định kỳ 21 ngày
ĐC 6 0 45 0
CTVK106 6 0 12 0
CTVK105 6 0 45 0
CTVK104 6 0 45 0
Tổng 36 0 147 0
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43
Tổng 107 0 239 0
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44
Kết quả gây cảm nhiễm vi khuẩn V. paraheamolyticus 13-041 trên tôm thẻ ở thí nghiệm trên cho thấy mặc dầu tỉ lệ tôm chết vẫn giữ ở mức tương đối cao so với thí nghiệm 1, nhưng theo kết quả mô bệnh học (0/239 dương tính), vì vậy có thể khẳng định được vi khuẩn V. paraheamolyticus 13-041 không liên quan tới AHPND.
Theo số liệu về báo cáo đề tài “Nghiên cứu xác định nguyên nhân gây bệnh hoại tử gan tụy trên tôm tại các tỉnh phía Bắc năm 2012” do Viện NTTS1 chủ trì, tỷ lệ tôm nhiễm V.parahaemolyticus là rất cao (chiếm 69,5%
trong tổng số vi khuẩn Vibrio phân lập được). Được sự đồng ý của đề tài, chúng tôi tiến hành thí nghiệm 3 gây nhiễm chủng V.parahaemolyticus ký kiệu là V.parahaemolyticus (12.020) là vi khuẩn được phân lập trong năm 2012 tại Hải phòng từ ao nuôi tôm được khẳng định chắc chắn là phân lập từ tôm bị AHNPD theo phương pháp mô bệnh học, để xác định có hay không vi khuẩn này là tác nhân gây ra AHNPD. Chúng tôi tiến hành gây nhiễm vi khuẩn này ở 3 nghiệm thức (1)Vi khuẩn + nước muối sinh lý; (2) Vi khuẩn + dịch nuôi cấy; (3) Dịch nuôi cấy vi khuẩn) để bước đầu đánh giá về phase và vấn đề sinh độc tố của vi khuẩn và 1 nghiệm thức đối chứng
* Kết quả thí nghiệm 3:
- Tỷ lệ chết ở tôm là 100% trong thời gian 32h
- Tiến hành thu mẫu phân lập vi khuẩn và xét nghiệm theo phương pháp mô bệnh học chúng tôi thu được kết quả như sau:
Bảng 3.5: Kết quả tái phân lập vi khuẩn thí nghiệm 3 Công thức
TN Số lượng mẫu Kết quả tái phân lập vi
khuẩn V.paraheamolyticus Tỷ lệ 3 nghiệm thức
(5.107) 15 15 100%
Đối chứng 5 0 0%
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45
Hình 3.4: Thử sinh hóa V. paraheamolyticus tái phân được Bảng 3.6: Kết quả phân tích mô bệnh học thí nghiệm 3
Công thức TN Số lượng mẫu
Biến đổi mô học
Vi khuẩn Hoại tử
Bong tróc tế
bào
Giảm TB B, R, E
AHPND (+)
VK+ Nacl 8 3/8 8/8 8/8 2/8 8/8
VK+ dịch nuôi cấy 5 2/5 5/5 5/5 1/5 5/5
Dịch nuôi cấy 2 2 2/2 2/2 - 2/2
Tổng 15 7/15 15/15 15/15 3/15 15/15
Đối chứng 5 0 0 0 0 0/5
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46
Hình 3.5: Tổ chức mô của tôm bị AHPND
(Mũi tên đen: Các tế bào máu tập hợp ở khoảng giữa ống gan tụy và nhiễm khuẩn) Kết quả gây nhiễm vi khuẩn V.parahaemolyticus 12.020 trên tôm thẻ chân trắng khỏe với các nghiệm thức khác nhau cho thấy rằng vi khuẩn này có khả năng gây hoại tử gan tụy cấp. Đặc điểm mô bệnh học tôm mắc phải AHPND theo định nghĩa của Lightner và cộng sự (2012) và hướng dẫn nhận biết dấu AHPND (Cục Thú y, 2012) là cấu trúc mô gan tụy bị biến đổi, có hiện tượng suy giảm tế bào B, F và R, các tế gan thoái hóa rơi vào lòng ống và xuất hiện các cụm vi khuẩn trong vùng bị hoại tử (Hình 3.5). Trong nghiên cứu của Nguyễn Trọng Nghĩa và cộng sự (2013) khi phân lập và xác định khả năng gây hoại tử cuả vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trên địa bàn tỉnh Bạc Liêu cho thấy vi khuẩn này có khả năng gây hoại tử gan tụy cấp khi gây cảm nhiễm thực nghiệm trên tôm thẻ chân trắng ở nghiệm thực 105 cfu/g (sau 9 ngày và 106 cfu/g (sau 6 ngày) với dấu hiệu bệnh lý và mô bệnh học tương tự thí nghiệm mà chúng tôi đã thực hiện.