2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành từ 10/2014 – 11/2015, tại phòng Sinh lí Thực vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.2. Vật liệu thực vật
Cây lan Hồ điệp mãn thiên hồng do phòng Sinh lí Thực vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp.
2.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ Các thiết bị:
Cân kĩ thuật: GM612 (Đức), tủ lạnh sâu: FRIGO, máy đo pH:
HM30G/TOA (Đức), nồi hấp khử trùng: HV – 110/HIRAYAMA (Nhật), máy cất nước hai lần (Trung Quốc), buồng cấy vô trùng: AV-100/TELSTAR, micropipet Jinson cỏc loại 200-1000àl (Phỏp), mỏy khấy từ ra nhiệt ARE/VELP (Italia).
Dụng cụ: các loại bình tam giác, cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50ml, 15ml...), nút bông, giấy báo, giấy thấm, giấy bạc, túi nilon, dao, khay cấy, panh, kéo...
2.2.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường sử dụng nuôi cấy là MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962).
Chất điều hòa sinh trưởng: BAP, NAA do hãng Duchefa của Hà Lan cung cấp.
2.2.3. Điều kiện nuôi cấy in vitro
Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo.
- Ánh sáng: các mẫu đều được nuôi cấy với cường độ chiếu sáng 5000- 8000lux.
- Quang kì: 16 giờ/ngày.
14 - Nhiệt độ phòng: 250C – 270C.
- Độ ẩm trung bình: 70% - 74%.
2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Chọn cành hoa có chồi ngủ, cắt thành các đoạn (2-3 cm) chứa mắt ngủ.
Rửa sạch dưới vòi nước, khử trùng bề mặt của mẫu cấy bằng etanol 70% và dung dịch javel (5%, 7%, 10%, 15%) trong thời gian (5 phút và 7 phút ), cuối cùng rửa lại bằng nước cất khử trùng 2-3 lần. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường ẵ MS (Murashige và Skoog, 1962), sacarozơ 30g/l và agar 6 g/l. Theo dõi tỷ lệ mẫu sạch-sống sau 7 ngày nuôi cấy.
Bảng 2.1. Công thức khử trùng bề mặt các đoạn của cành hoa lan Hồ điệp mãn thiên hồng
Công thức Chất xử lí/thời gian
ĐC Xử lí sơ bộ
CT1 Xử lí sơ bộ+Javen5%(v/v)/5 phút CT2 Xử lí sơ bộ+Javen5%(v/v)/7 phút CT3 Xử lí sơ bộ+Javen7% (v/v)/5 phút CT4 Xử lí sơ bộ+Javen7% (v/v)/7 phút CT5 Xử lí sơ bộ+Javen10% (v/v)/5 phút CT6 Xử lí sơ bộ+Javen10% (v/v)/7 phút CT7 Xử lí sơ bộ+Javen15% (v/v)/5 phút CT8 Xử lí sơ bộ+Javen15% (v/v)/7 phút
15 Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ mẫu nhiễm (%): (tổng số mẫu nhiễm/ tổng số mẫu cấy vào)x100 - Tỷ lệ mẫu sống (%): (tổng số mẫu sống/ tổng số mẫu cấy vào)x100 - Tỷ lệ mẫu chết (%): (tổng số mẫu chết/ tổng số mẫu cấy vào)x100 2.3.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng 2.3.2.1. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ mô lá
Lá của chồi tái sinh từ cành hoa 12 tuần tuổi được sử dụng. Mảnh lá được cắt với kớch thước 1,0-1,5cm2, được nuụi cấy lờn mụi trường ẵMS, sacarozơ 30g/l, agar 6 g/l, bổ sung BAP và NAA với các nồng độ khác nhau như bảng 2.2.
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro từ mô lá lan Hồ điệp mãn thiên hồng
Môi trường BAP(mg/l) NAA(mg/l)
L1 9,0 1,0
L2 9,0 1.5
L3 10,0 1,0
L4 10,0 1,5
L5 11,0 1,0
L6 11,0 1,5
Đánh giá quá trình phát sinh hình thái chồi, hệ số nhân nhanh chồi sau 12 tuần nuôi cấy.
2.3.2.2. Nhân nhanh chồi lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ đốt thân Chồi tái sinh từ cành hoa được đặt sang môi trường nhân nhanh. Đối với đốt thõn, kớch thước 3 cm được nuụi cấy lờn mụi trường ẵMS, sacarozơ 30g/l, agar 6 g/l và BAP với các nồng độ khác nhau (2,5mg/l, 5mg/l, 8mg/l, 10mg/l)
16
hoặc BAP (2,5mg/l, 5mg/l, 8mg/l, 10mg/l) kết hợp nước dừa 10%(v/v) (bảng 2.3)
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của BAP và nước dừa đến quá trình nhân nhanh chồi lan Hồ điệp in vitro từ đốt thân
Môi trường Có nước dừa Không có nước dừa
T1 B2,5 (mg/l) B2,5 (mg/l)
T2 B5,0 (mg/l) B5,0 (mg/l)
T3 B8,0 (mg/l) B8,0 (mg/l)
T4 B10,0 (mg/l) B10,0 (mg/l)
Đánh giá các chỉ tiêu sau 8 tuần nuôi cấy:
- Số chồi/mẫu - Số lá/chồi
- Chiều cao chồi (cm)
2.3.3. Ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Chồi in vitro được nuụi cấy trờn mụi trường ẵ MS cú bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau như bảng 2.4. Nhằm xác định nồng độ NAA thích hợp cho quá trình tạo rễ của cây.
Bảng 2.4. Ảnh hưởng của NAA đến sự ra rễ của cây lan Hồ điệp in vitro hoàn chỉnh
Môi trường NAA(mg/l)
R0 0,0
R1 0,5
R2 1,0
R3 1,5
R4 2,0
17
Đánh giá khả năng ra rễ của chồi in vitro và chiều dài rễ sau 4 tuần nuôi cấy.
2.3.4. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên
Cây lan Hồ Điệp in vitro hoàn chỉnh được đưa vào rèn luyện thích nghi với điều kiện tự nhiên trên các giá thể, xơ dừa sấy khô, xơ dừa + than tỉ lệ 1:1, than.
Đánh giá tỷ lệ sống sót (số cây sống/ số cây chết) của cây trên các giá thể sau 4 tuần rèn luyện.
2.4. Phân tích thống kê dữ liệu thực nghiệm
Số liệu được thu thập và xử lí thống kê bằng chương trình Excel 2010 theo mô tả của Nguyễn Văn Mã và cộng sự, 2013 [3].
18 CHƯƠNG 3