Lan Hồ điệp mãn thiên hồng là loại lan đơn thân, nhân giống bằng phương pháp sử dụng đỉnh chồi nhân giống trong nuối cấy in vitro gây ảnh hưởng tới cây mẹ. Việc tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ mảnh lá không gây ảnh hưởng tới cây mẹ. Đã có nhiều tác giải tiến hành nghiên cứu tạo protocorm từ mảnh lá như Kano (1971); Tanka và cộng sự (1975)…Tanka và Skanishi (1977, 1980, 1985) sử dụng lá của cây trưởng thành và cây con nảy mầm từ hạt, nuôi cấy trên môi trường MS.
Mảnh lá in vitro rất khó phát sinh chồi trong nuôi cấy. Phân tích bảng 3.2 cho thấy chỉ duy nhất ở công thức 3 có chứa BAP (10 mg/l) và NAA (1,0 mg/l), sau 6-8 tuần nuôi cấy thì các mẫu lá bắt đầu tạo mô sẹo (hình 3.2A). Đến tuần thứ 18-22, tạo PLB (protocorm-like bodies) (hình 3.2C, D). Số lượng PLB đạt 12. Sau nhiều lần cấy chuyển trên môi trường nhân nhanh, PLB hình thành chồi in vitro (hình 3.2 E).
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi bất định từ mô lá
CT Nồng độ Hệ số nhân
nhanh (chồi) BAP (mg/l) NAA (mg/l)
L1 9,0 1,0 -
L2 9,0 1,5 -
L3 10,0 1,0 12
L4 10,0 1,5 -
L5 11 1,0 -
L6 11 1,5 -
Kết quả của nghiên cứu này cao hơn so với công bố của Tanaka và Sakanishi (1977, 1980) sử dụng BAP (10 mg/l) và NAA (1 mg/l), số PLB tái
21
sinh từ lá đạt 3,8. Trong khi đó, theo Hong et al (2002), môi trường tốt nhất để tạo PLB là 3 mg/l TDZ cho trung bình 14 PLB/ mẫu.
Hình 3.2. Quá trình tạo mô sẹo và hình thành chồi từ mô lá
(A, B, C, D, E): Mảnh lá 4 tuần tuổi được nuôi cấy. (A), (B). Mảnh lá mô sẹo sau 4 và 8 tuần nuôi cấy; (C), (D), (E). Chồi tái sinh từ mảnh lá sau 16, 20-22 và 24 tuần nuôi cấy. (F). Mảnh lá 10-12 tuần tuổi tái sinh chồi.
22
3.2.2. Nhân nhanh chồi lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ đốt thân Các nghiên cứu thường thực hiện tạo chồi in vitro thông qua hình thành PLB. Tuy nhiên, PLB có xu hướng sinh trưởng và phát triển chậm hơn so với chồi được phát sinh trực tiếp (Wagner et al, 2007).
Ảnh hưởng của BAP
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân lan Hồ điệp được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân của lan Hồ điệp mãn thiên hồng sau 6 tuần nuôi cấy
CT Số chồi/mẫu Số lá/thân Chiều cao cây (cm)
T1 2,00a 4,25a 2,13b
T2 2,25a 3.25a 0,93a
T3 6,75b 2,00b 0,75a
T4 4,00a 4,00a 1,37ab
LSD 2.33 1,04 0,85
Trong cùng một cột, chữ số khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với α=0,05
Kết quả cho thấy, BAP có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro. Trong đó hiệu quả nhất là môi trường nuôi cấy T3 (8 mg/l BAP) sau 2 tuần nuôi cấy đã xuất hiện chồi và sau 6 tuần nuôi cấy cho hệ số chồi cao 6,75 (hình 3.3B). Tuy nhiên, chiều cao chồi tái sinh lại thấp nhất, chỉ đạt 0,75 (cm). Chiều cao này sẽ gây khó khăn cho quá trình thao tác nuôi cấy. Đối với môi trường T1 (2,5 mg/l BAP), T2 (5mg/l BAP), số chồi/mẫu thấp hơn, lần lượt là 2,00 và 2,25 (hình 3.3) nhưng có số lá/thân (4,25 lá/thân, 2,13 cm) cao hơn so với chồi được nuôi trên môi trường T3 (2,00).
23 Ảnh hưởng của BAP kết hợp nước dừa
Nước dừa được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô, ảnh hưởng tới sinh trưởng và các đặc trưng khác của sinh trưởng (Baque et al, 2011). Nước dừa là nguồn dinh dưỡng dồi dào cung cấp nguồn đạm (từ nhiều loại axit amin, axit hữu cơ), cacbonhydat (glucoza, fructoza, sucrose). Ngoài ra trong nước dừa còn chứa một số chất điều hòa sinh trưởng, được biết đến là zenatin (Arditti, 1992).
Hiệu quả của nước dừa đối với quá trình tái sinh chồi in vitro thường được tăng cường khi môi trường có bổ sung cytokinin. Trong nghiên cứu này, nước dừa 10% được bổ sung vào môi trường chứa BAP (2,5; 5,0; 8,0; 10,0 mg/l). Kết quả được thể hiện bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP và nước dừa đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân của lan Hồ điệp mãn thiên hồng sau 6 tuần nuôi
cấy
CT Số chồi/mẫu Số lá/thân Chiều cao cây (cm)
T1 3,00a 5,00b 2,25b
T2 3,75a 2,75a 1,30a
T3 9,00b 2,50a 0,92a
T4 6,5c 4,00c 1,50ab
LSD 1,24 0,86 0,92
Trong cùng một cột, chữ số khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với α=0,05
Phân tích bảng 3.4 cho thấy môi trường T3 (8 mg/l BAP + 10% nước dừa), cho số chồi hình thành nhiều nhất (9,00 chồi) (hình 3.3C), tuy nhiên chiều cao chồi lại thấp nhất (0,92 cm) so với các công thức còn lại. Trong khi đó, môi
24
trường T1 (10mg/l BAP + 10% nước dừa) cho số chồi/mẫu thấp hơn đạt 3 chồi/mẫu nhưng chiều cao chồi đạt 2,25 cm. Chiều cao chồi in vitro ở công thức T4 giúp thao tác nuôi cấy trở nên thuận lợi hơn so với các công thức còn lại. Vậy khi bổ sung nước dừa 10% vào môi trường nuôi cấy làm tăng khả năng hình thành chồi, phát triển lá và chiều cao cây so với môi trường không bổ sung nước dừa. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Parisa (2014) và Nguyễn Thị Sơn và cộng sự (2014).
Hình 3.3. Nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng từ đốt thân