Theo nguyên tắc của phương pháp: do Artesunat không trực tiếp phản ứng với thuốc thử diazoni mà nó phản ứng trước với kiềm tạo thành sản phẩm trung gian Q289, sau đó Q289 mới phản ứng với thuốc thử diazoni tạo sản phẩm cuối cùng Q345. Vì thế, trước tiên chúng tôi khảo sát việc chuyển Artesunat thành sản phẩm trung gian Q289.
♦ Để xác định xem artesunat đã chuyển hết sang Q289 chưa, chúng tôi tiến hành thực nghiệm sau:
- Thực nghiệm 1 (dùng dung dịch NaOH IN như [26]):
Cân 0,lg artesunat vào cốc có mỏ, hoà tan bằng ethanol tuyệt đối,rồi chuyển vào bình định mức dung tích 50ml,thêm dung môi đến vạch, lắc đều (dung dịch A). Lấy chính xác 5,0ml dung dịch A cho vào bình định mức dung tích 50ml khác, thêm dung dịch NaOH IN đến vạch, đậy nút bình, lắc đều.
Sau đó để yên ở nhiệt độ phòng 5 phút.
Đem đo phổ hấp thụ của dung dịch thu được ở bước sóng 289 ± Inm, cuvet dày lcm. Mẫu trắng là dung dịch NaOH IN.
Kết quả thu được: phổ hấp thụ của sản phẩm không rõ, tại bước sóng 289 nm độ hấp thụ của sản phẩm rất thấp ( D = 0,143 ).
♦ Vì vậy, để tiến hành chuyển hết Artesunat sang sản phẩm trung gian Q289, chúng tôi lấy phương pháp ghi trong tiêu chuẩn ngành làm cơ sở:
Để rút ngắn thời gian làm ấm ở nhiệt độ 50 ± l°c trong nồi cách thuỷ [TCN], chúng tôi dùng dung dịch NaOH 0,2N và làm thí nghiệm sau:
- Thực nghiệm 2:
Làm giống thực nghiệm 1 nhưng thay dung dịch NaOH IN bằng dung dịch NaOH 0,2N. Sau khi thêm dung dịch NaOH 0,2N đến vạch, đậy nút bình, lắc đều. Làm ấm trong nồi cách thuỷ ở 50 ± l°c trong các khoảng thời gian khác nhau: 20; 25; 30; 35; 40; 45; 50; 55; 60 phút. Lấy ra làm nguội nhanh và đo độ hấp thụ ở bước sóng 289 ± lnm, cuvet dày lcm.
Mẫu trắng là dung dịch NaOH 0,2N. Kết quả thu được ghi ở bảng 1:
Bảng 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian làm ấm đến độ hấp thụ
Thời gian ( phút) Độ hấp thụ ( D )
20 0,791
25 0,852
30 0,852
35 0,888
40 0,900
45 0,899
50 0,898
55 0,890
60 0,885
Qua kết quả trên, nếu làm ấm từ 40 - 50 phút là dung dịch có độ hấp thụ tối đa và hầu như không thay đổi. Mặt khác, khi tiến hành đo độ hấp thụ của
dung dịch chuẩn bị như trong TCN[1] thì độ hấp thụ cũng tương tự. Do vậy, chúng tôi chọn dùng dung dịch NaOH 0,2N với thời gian đun cách thuỷ 50 ±
l°c là 45 phút.
2.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sản phẩm cuối cùng ( Q345):
• Khảo sát ảnh hưòng của lương acid acetic 1,1M( dùng để acid hoá mỏi trường ) đến kết quả đinh lương:
Theo [26], phương pháp này có thể dùng để định lượng được cả các thuốc sốt rét khác: Artemisinin, Artemether, Cloroquine, Quinine, Primaquin, Sulíadoxin và Pyrimethamine ở pH 4,6 và 8. Nhưng nó đặc hiệu với Artesunat ở pH ô 4. Vỡ vậy, tỏc giả đó dựng dung dịch acid acetic 1,1M để acid hoỏ mụi trường trong định lượng viên nén artesunat.
Do áp dụng cụ thể với nguyên liệu artesunat nên chúng tôi chỉ tiến hành ở pH ô 4. Theo [26] và qua khảo sỏt, chỳng tụi dựng 4,0 ml dung dịch acid acetic 1,1M để acid hoỏ mụi trường là đạt được pHô 4. Vỡ vậy, chỳng tụi chỉ khảo sát lượng acid acetic 1,1M trong khoảng 4 ± 0,5 ml (cụ thể là: 3,5 ml;
4,0ml; 4,5ml) và tiến hành như sau:
- Thực nghiệm 3:
Cân chính xác 0,lg Artesunat, hoà tan bằng Ethanol tuyệt đối và chuyển vào bình định mức dung tích 50ml, thêm dung môi đến vạch, lắc đều (dung dịch A ). Lấy chính xác 5,0ml dung dịch A cho vào bình định mức dung tích 50ml khác, thêm lOml dung dịch NaOH 0,2N, đậy nút, đun cách thuỷ ở 50±l°c trong 45 phút. Làm nguội bằng nước lạnh và thêm các lượng khác nhau dung dịch acid acetic 1,1M: 3,5ml; 4,0ml; 4,5ml, lắc đều. Thêm 5,0ml dung dịch ZnCl2 0,5% và lOml dung dịch thuốc thử diazoni. Thêm nước cất vừa đủ, trộn đều. Để yên trong 15 phút.
Song song tiến hành làm mẫu trắng giống như trên trong cùng điều kiện ( không có 5ml dung dịch A ).
Đo mật độ quang của các dung dịch ở bước sóng 345nm, cuvet dày lcm. Kết quả thu được ở bảng 2.
Bảng 2: Ảnh hưởng của lượng dung dịch acid acetic 1,1M đến độ hấp thụ của sản phẩm phản ứng.
V dung dịch acid acetic 1,1M (ml) 3,5 4,0 4,5
PH 4,26 4,31 4,37
Độ hấp thụ 0,488 0,489 0,487
Số liệu ở bảng 2 cho thấy: với lượng acid acetic 1,1M từ 3,5 đến 4,5ml mật độ quang thu được của dung dịch sản phẩm không thay đổi và pH dung dịch ô 4. Vỡ vậy, chỳng tụi dựng 4ml dung dịch acid acetic 1,1M để acid hoỏ môi trường.
• Khảo sát lương thuốc thử cán dùng và cách pha:
Theo [26], tác giả dùng thuốc thử là Fast TR Red salt với nồng đồ 5mg/ml ( với dung môi là nước c ấ t). Song trong điều kiện không có thuốc thử trên, chúng tôi đã thay thế bằng một loại muối diazoni khác được pha dựa theo Dược điển quốc tế (DĐQT). Theo DĐQT, thuốc thử diazoni này ở dạng dung dịch với nồng độ thấp ( ô 0,34mg/ml ) nờn thể tớch thuốc thử cần dựng cho phản ứng là rất lớn. Vì vậy, chũng tôi tiến hành pha lại như sau:
- Theo DĐQT: cân 0,9g acid sulfanilic và thêm 10ml acid hydrocloric ( 250g/l), thêm nước cất vừa đủ 100ml, được dung dịch 1.
Lấy 3ml dung dịch 1 cho vào bình lOOml khác, thêm 5ml dung dịch NaN02 ( 3g/l), làm lạnh trong đá 5 phút, sau đó thêm 20ml dung
dịch NaNOa ( 3g/l) và tiếp tục làm lạnh trong đá, thêm nước cất vừa đủ lOOml. Bảo quản dung dịch trong đá. ( Diazobenzensulfonic acid phải được pha ngay và để ít nhất 15 phút mới được dùng ).
- Chúng tôi thay đổi lại cách pha như sau: cân 0,9g acid sulfanilic cho vào bình định mức lOOml, thêm lOml dung dịch HC1 (250g/l), thêm nước cất đến vạch, được dung dịch 1.
Lấy 20ml dung dịch 1 cho vào bình định mức lOOml khác, thêm 5ml dung dịch NaN02 2%, làm lạnh trong đá 10 phút và thêm tiếp 20ml dung dịch NaN02 2% vào, vẫn để lạnh trong đá. Thêm nước cất vừa đủ lOOml, lắc đều. Bảo quản trong đá 15 phút mới được dùng.
Với cách pha trên, nồng độ dung dịch thuốc thử tăng lên
* 2,3mg/ml. Ở nồng độ đó, thể tích thuốc thử cần dùng là: 25 ml [26].
Nhưng qua thực nghiệm chúng tôi thấy: khi dùng 10 ml dung dịch thuốc thử muối Diazoni pha ở trên thì độ hấp thụ của dung dịch vẫn đạt tối đa (tương tự như khi dùng 25 ml).
• Khảo sát ảnh hưởng cuả kẽm clorid đến đô hấp thu của sản phám cuối cùng:
Để thuận tiện cho việc nghiên cứu chúng tôi dùng dung dịch ZnCl2 0,5%
và tiến hành các thực nghiệm sau:
Thực nghiệm 4:
Tiến hành giống thực nghiệm 3 đến khi làm nguội bằng nước máy.
Thêm 4ml dung dịch acid acetic 1,1M, lắc đều. Thêm 5ml dung dịch ZnCl2 0,5% và cho tiếp lOml dung dịch thuốc thử Diazoni vào. Thêm nước cất vừa đủ 50ml, lắc đều.
Song song làm mẫu trắng giống như trên trong cùng điều kiện ( không có 5ml dung dịch A ).
Đo mật độ quang của dung dịch này ở bước sóng 345nm, cuvet dày lcm. Kết quả ghi ờ bảng 3.
I
- Thực nghiệm 5: thực hành giống thực nghiêm 4 nhưng không cho 5ml dung dịch ZnCl2 0,5%. Kết quả ghi ở bảng 3.
Bảng 3: Ảnh hưởng của ZnCl2 0,5% đến độ hấp thụ của sản phẩm cuối cùng.
t ( phút) Độ hấp thụ của mẫu 1 (có ZnCl2), (m, = 0,0999)
Độ hấp thụ của mẫu 2 (không có ZnCl2), (m2 = 0,1001)
5 0,475 0,490
10 0,489 0,481
15 0,488 0,470
20 0,486 0,464
25 0,488 0,455
30 0,481 0,442
35 0,480 0,436
Qua số liệu ở bảng 3 cho thấy, khi không có ZnCl2 0,5% thì phản ứng xảy ra nhanh hơn nhưng sản phẩm cuối cùng lại không bền, độ hấp thụ giảm rất nhanh. Còn khi có ZnCl2 0,5% thì phản ứng xảy ra từ từ và ít thay đổi.
Trong khoảng thời gian từ 10 đến 25 phút, độ hấp thụ hầu như không thay đổi, chứng tỏ sản phẩm tạo thành cuối cùng bền vững hơn.
Vì vậy, chúng tôi dùng 5,0 ml ZnCl2 0,5% và chọn thời gian để phản ứng là 15 phút.