2.4. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP
2.4.4. Xác định tính đặc hiệu của phương pháp
Các tạp chất có lẫn trong Artesunat nguyên liệu, thường gặp nhất là Dihydroartemisinin ( DHA ), tạo ra do Artesunat bị thuỷ phân trong quá trình sản xuất và bảo quản hoặc chính là nguyên liệu ban đầu để bán tổng hợp Artesunat nhưng chưa phản ứng hay chưa loại hết.
Theo [5], khi định lượng Artesunat theo phương pháp TCN, DHA ảnh hưởng rất lớn tới kết quả định lượng.
Trong phương pháp chúng tôi vừa xây dựng, do có giai đoạn đầu tạo sản phẩm Q289 nên DHA sẽ ảnh hưởng tới độ hấp thụ của sản phẩm trung gian Q289. Để khảo sát ảnh hưởng của DHA đến độ hấp thụ của sản phẩm cuối cùng Q345 và xác định tính đặc hiệu của phương pháp vừa xây dựng, chúng tôi tiến hành thực nghiệm sau:
• Thực nghiệm 1:
Cân chính xác khoảng 0,lg Artesunat và 0,1 g DHA, hoà tan riêng rẽ mỗi loại trong ethanol tuyệt đối rồi chuyển vào 2 bình định mức riêng biệt có dung tích 50ml, thêm ethanol tới vạch, lắc đều. Thu được dung dịch A ( chứa Artesunat) và dung dịch B ( chứa DHA ).
Lấy chính xác 5ml dung dịch A và 5ml dung dịch B cho vào 2 bình định mức 50ml riêng biệt, thêm vào mỗi bình lOml dung dịch NaOH 0,2N.
Đun cách thuỷ 45 phút ở 50 ± l°c, làm nguội nhanh bằng nước máy. Sau đó thêm vào mỗi bình 4ml dung dịch acid acetic 1,1M, lắc đều. Thêm 5ml dung dịch ZnCl2 0,5% và lOml dung dịch thuốc thử diazoni, thêm nước cất đến vạch, lắc đều. Để yên 15 phút.
Song song làm mẫu trắng ( không có 5ml dung dịch A và dung dịch B ) trong cùng điều kiện.
Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch thu được ở bước sóng 345nm. Kết quả ghi ờ bảng 7.
Bảng 7: Độ hấp thụ của DHA và Artesunat ở bước sóng 345nm
Khối lượng (g) Độ hấp thụ của DHA Độ hấp thụ của Artesunat
0,1000 0,656 0,490
0,1014 0,709 0,500
Nhận xét: như vậy DHA sau khi thuỷ phân trong môi trường kiềm cũng tạo sản phẩm hấp thụ tử ngoại ở 289nm, và sản phẩm này sau khi phản ứng với thuốc thử Diazoni cũng tạo ra sản phẩm cuối cùng hấp thụ tử ngoại ở 345nm.
• Thực nghiệm 2:
Để khảo sát ảnh hưởng của DHA đến độ hấp thụ tử ngoại của Artesunat chúng tôi tiến hành như sau:
Cân chính xác khoảng 0,lg Artesunat, hoà tan bằng ethanol tuyệt đối, chuyển vào bình định mức dung tích 50ml, thêm ethanol đến vạch, trộn đều ( dung dịch A ).
Cân chính xác khoảng 0,01g DHA, hoà tan bằng ethanol tuyệt đối, chuyển vào bình định mức dung tích 50ml, thêm ethanol tới vạch, trộn đều ( dung dịch B ).
Chuẩn bị 5 bình định mức dung tích 50ml: lần lượt lấy chính xác 5ml dung dịch A cho vào 5 bình và lấy chính xác các lượng khác nhau: 0; 0,5; 1,0;
1,5; 2,0ml dung dịch B cho lần lượt vào các bình trên. Sau đó cho vào mỗi bình lOml dung dịch NaOH 0,2N, đun cách thuỷ ở 50 ± l°c, trong vòng 45 phút. Làm nguội nhanh bằng nước lạnh và thêm vào 4ml dung dịch acid acetic 1,1M lắc đều. Sau đó thêm 5ml dung dịch ZnCl2 0,5% và thêm lOml dung dịch thuốc thử Diazoni, thêm nước cất vừa đủ, trộn đều. Để yên 15 phút.
Đem các dung dịch thu được đo độ hấp thụ ở bước sóng 345nm, cuvet dày lcm, với mẫu trắng làm trong cùng điều kiện ( không có dung dịch A và B ).
Kết quả đo được ghi ở bảng 8.
_ ọ
Bảng 8: Anh hưởng của DHA đến độ hấp thụ của sản phẩm cuối cùng.
Bình 1 2 3 4 5
Dung dịch A ( m l) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Dung dich B 0 0,5 1,0 1,5 2,0
Làm phản ứng như trên và bổ sung nước vừa đủ 50ml, để yên 15 phút
% DHA thêm vào 0 1 2 3 4
Độ hấp thụ 0,488 0,495 0,504 0,512 0,516
• Thực nghiệm 3: cân và tiến hành như thực nghiêm 2 song thay DHA bằng Artesunat. Kết quả thu được ghi ở bảng 9.
Bảng 9: Ảnh hưởng của % Artesunat đến độ hấp thụ của sản phẩm cuối cùng.
Bình 1 2 3 4 5
Dung dịch A ( m l) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Dung dịch B 0 0,5 1,0 1,5 2,0
Làm phản ứng như trên và bổ sung nước vừa đủ 50ml, để yên 15 phút
% Artesunat thêm vào 0 1 2 3 4
Độ hấp thụ 0,489 0,495 0,502 0,504 0,509
Từ bảng 8 và bảng 9 cho thấy, khi thêm 1% DHA thì kết quả định lượng tăng trung bình 0,007 đơn vị, còn khi thêm 1% Artesunat thì kết quả định lượng tăng trung bình 0,005 đơn vị. Từ kết quả này và kết quả ở bảng 8, chúng tôi thấy với cùng một khối lượng cân thì độ hấp thụ của sản phẩm tạo
thành từ DHA lớn hơn độ hấp thụ của sản phẩm tạo thành từ Artesunat trong cùng 1 điều kiện môi trường là 1,4 lần. Như vậy, khi lẫn 1 % DHA thì kết quả định lượng tăng 1,4%. Sự có mặt của DHA đã làm sai kết quả định lượng, cụ thể là làm tăng kết quả định lượng. Tuy nhiên với mẫu Artesunat có hàm lượng DHA thấp, hay xấp xỉ hàm lượng DHA trong mẫu đối chiếu thì kết quả định lượng ít phụ thuộc vào hàm lượng DHA. Trong TCN quy định lượng DHA phải ít hơn 1%. Tuy nhiên nếu có chất chuẩn Artesunat với hàm lượng DHA không đáng kể thì 1% DHA có mặt sẽ làm tăng kết quả định lượng lên rất nhiều ( 1,4% ). Như vậy, mức độ ảnh hưởng của DHA đến kết quả định lượng ở cả 2 phương pháp là như nhau.
PHẦN 3