1.1 Sơ lược về enzyme
Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học, là các chất xúc tác sinh học (Phạm Thị Trân Châu et al., 1997).
Enzyme có thể làm tăng tốc độ phản ứng từ 105 – 1017 lần, có hoạt độ xúc tác lớn hơn nhiều so với các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác (Phạm Thị Trân Châu et al., 2010).
1.2 Enzyme amylase
Amylase là một loại enzyme có ý nghĩa về mặt sinh lý, thương mại và lịch sử, còn được gọi là diatase. Enzyme này có ở cả thực vật lẫn động vật.
Enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glycoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước.
Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin ngắn hơn.
Enzyme amylase phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là một trong những enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực khác, đặc biệt là trong các ngành công nghiệp thực phẩm để làm lỏng tinh bột.
Amylase thường được thu nhận từ hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men, vi khuẩn.
Enzyme amylase có thể xúc tác cho các phản ứng thủy phân tinh bột, glycogen, các polysaccharide tương tự, amylase được chia ra làm 3 loại: - amylase, -amylase và glucoamylase.
- -amylase (1,4--D-Glucan-glucanohydrolase; EC 3.2.1.1) có trong nước bọt, hạt hòa thảo nảy mầm, trong tụy tạng, nấm mốc, vi khuẩn. Nó phân giải liên kết 1,4-glycoside ở giữa chuỗi polysaccharide tạo thành dextrin phân tử thấp.
Dưới tác dụng của enzyme này, dung dịch tinh bột nhanh chóng bị mất khả năng tạo màu với dung dịch iod và bị giảm độ nhớt mạnh. -amylase bền với nhiệt, nhưng kém bền với acid.
- -amylase (EC 3.2.1.2) có nhiều ở hạt, củ thực vật. Xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4-glycoside từ đầu không khử tạo thành chủ yếu là mantose
xxvi
và dextrin phân tử lớn. Mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70C, nhưng bền với acid hơn -amylase
- Glucoamylase (EC 3.2.1.3) có nhiều ở vi sinh vật, gan động vật. Xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4- và 1,6-glycoside bắt đầu từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Sản phẩm chủ yếu là glucose và dextrin.
(Nguyễn Văn Mùi, 2001).
Các loại amylase đều có ở các loại thực vật, động vật và vi sinh vật. Khi hạt nảy mầm, hoạt tính của amylase tăng lên làm thủy phân tinh bột thành đường cần cho sự phát triển của phôi (Lâm Thị Kim Châu et al., 2004)
1.3 Nguyên tắc thí nghiệm
Phương pháp quang phổ là một phương pháp phân tích, định lượng các chất hóa học, được ứng dụng nhiều trong nhiều ngành khoa học như hóa sinh, hóa phân tích, hóa vô cơ, hóa hữu cơ, hóa lý, hóa địa chất, hóa dược, hóa pháp y và nhiều ngành khoa học khác. Là phương pháp dựa trên định luật Lamber-Beer, đơn giản, dễ thực hiện, có độ chính xác và tin cậy cao (Nguyễn Nghiêm Luật, 2003).
Amylase có khả năng thủy phân tinh bột thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Khi cho tác dụng với iod chúng sẽ tạo màu. Hoạt tính của enzyme amylase được đánh giá bằng cách ghi nhận lại lượng tinh bột còn lại sau phản ứng khi cho phản ứng với thuốc thử iod. Mật độ quang (optical density, OD) được đo bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 656 nm.
2. Nội dung bài thực hành 2.1 Phương tiện, phương pháp 2.1.1 Mẫu vật
Lúa được ngâm trong nước ấm khoảng 24 giờ, sau đó được để ráo trong khoảng 48 giờ tạo điều kiện cho lúa nảy mầm.
xxvii 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
Hóa chất Dụng cụ, thiết bị
Dung dịch iod Cối chày sứ, cốc thủy tinh
Cồn tuyệt đối Phễu lọc, giấy lọc
Hồ tinh bột Ống nghiệm, giá ống nghiệm
Kali iodide Ống nhỏ giọt, cân phân tích
Các thành phần thuốc thử Fehling Máy ly tâm, máy đo quang phổ 2.2 Tiến trình thí nghiệm
2.2.1 Trích amylase và tinh khiết hóa
Tiến trình trích và tinh khiết hóa amylase trong thí nghiệm dựa trên tài liệu của Lâm Thị Kim Châu (2004) được thực hiện như sau: Lúa nảy mầm 10 g được giã nát và cho vào 30 ml nước cất, khuấy đều, để lắng 15 phút, phần nước ở trên được đem lọc để lấy phần dịch lỏng, 4 lần thể tích cồn tuyệt đối được thêm vào để kết tủa amylase (và có thể là một số protein khác). Sau khi hỗn hợp dung dịch được ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, kết tủa amylase được lấy ra và hòa tan trong 20 ml nước cất, để được dung dịch amylase (và vài protein khác) khá tinh sạch, được sử dụng để khảo sát hoạt tính của enzyme amylase.
Dung dịch này không có chất đường khử được xác định bằng cách lấy 2 ml dung dịch amylase với 3 giọt thuốc thử Fehling và đun cách thủy. Nếu có chất đường khử kết quả dung dịch sẽ xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch.
2.2.2 Xác định hoạt tính amylase
Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme amylase được thực hiện như sau:
dung dịch tinh bột 1% được cho vào 2 ống nghiệm (ống 1: ống đối chứng và ống 2: ống thí nghiệm), mỗi ống 10 ml.
Sau 10 phút, cả 2 ống được ủ ở nhiệt độ 30C, ống 2 được thêm vào 2 ml dịch chiết enzyme. Sau đó hỗn hợp được lắc đều và giữ trong 10 phút.
Sau 10 phút ủ cho phản ứng xảy ra, 0,1 ml dung dịch từ mỗi ống được lấy ra và cho vào 2 ống nghiệm khác có chứa 10 ml dung dịch I2 phân tích (cách pha được trình bày trong phần phụ lục, trang 35) lắc đều sau đó hỗn hợp được đo mật độ quang ở bước sóng 656 nm. OD1 của ống đối chứng là lượng tinh bột ban đầu.
OD2 của ống thí nghiệm là lượng tinh bột còn lại sau khi enzyme amylase thủy
xxviii
phân. Sự khác nhau giữa OD1 và OD2 là lượng tinh bột bị enzyme thủy phân. Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại và lấy giá trị trung bình.
Lượng tinh bột bị thủy phân (m) được tính theo công thức:
1 2
1 ) 0,1
(
OD OD m OD
Trong đó: OD1: mật độ quang của dung dịch đối chứng OD2: mật độ quang của dung dịch thí nghiệm
0,1: lượng tinh bột thí nghiệm (g) 3. Kết quả và thảo luận
Sau khi trích amylase được thử với phản ứng Fehling kết quả không xuất hiện kết tủa đỏ gạch cho thấy dịch chiết amylase không có chất đường khử.
Enzyme trong hạt lúa nảy mầm gồm có amylase (-amylase và -amylase) protease và một số enzyme oxy hóa khử khác (Nguyễn Đức lượng, 2004). Do amylase bên trong hạt lúa là hỗn hợp của nhiều loại vì thế hoạt tính của enzyme amylase chỉ có thể được đánh giá một cách tương đối.
Tinh bột có màu xanh khi cho phản ứng với iod nên khi tinh bột đã được thủy phân đến oligosaccharide thì chúng sẽ không cho màu xanh với iod. Kết quả thí nghiệm là ống đối chứng có màu xanh, ống thí nghiệm có màu xanh nhạt hơn.
Thành phần chính của enzyme amylase là -amylase và -amylase, khi cho vào tinh bột, chúng sẽ thủy phân tinh bột tạo thành hỗn hợp nhiều maltose và các dextrin đơn giản hơn với sự khác nhau về khối lượng phân tử, khả năng khử và phản ứng màu với iod. Các dạng dextrin (trọng lượng phân tử nhỏ hơn) tác dụng với iod cho màu khác nhau từ xanh tím đến tím nhạt, đỏ, vàng sẫm và mất màu theo mức độ giảm dần của trọng lượng phân tử. Amylodextrin cho màu tím, erytrodextrin cho màu đỏ nâu, acrodextrin và maltodextrin không cho phản ứng màu với iod (Nguyễn Quang Vinh et al., 2007)
-amylase cắt những phân tử của amylose và amylopectin thành những đoạn có nhánh hoặc không, có kích thước nhỏ hơn phân tử tinh bột (dextrine).
Những đoạn cắt đầu tiên thường còn rất phức tạp và cho màu đỏ với iod (erythrodextrine).
xxix
Tiếp đến là những đoạn nhỏ hơn không cho màu với iod (oligosacchride), tiếp đó các dextrine được thủy phân thành các disaccharide khử oxy, đó là maltose.
-amylase sẽ tách phân tử maltose từ các đầu tự do của các phân tử amylose và amylopectin. Như vậy phân tử không nhánh của amylose sẽ hoàn toàn biến đổi thành maltose trong khi phân tử amylopectin sẽ cho ta maltose và các phân tử dextrine có nhánh.
Sau đây là kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme amylase sau khi đo mật độ quang của hỗn hợp thí nghiệm ở bước sóng 656 nm.
Bảng 1: Giá trị OD sau 3 lần thực hiện thí nghiệm xác định hoạt tính amylase
Giá trị OD Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
OD1 0,842 0,828 0,781 0,817
OD2 0,385 0,331 0,292 0,336
Lượng tinh bột trung bình bị thủy phân là 0,059g. Giá trị nằm trong khoảng 0,02g – 0,07g phù hợp với tài liệu của Nguyễn Văn Mùi (2001).