Bài 5: Định lượng Vitamin C bằng phương pháp Muri
1.2 Nguyên tắc thí nghiệm
2.1.3 Tiến trình thí nghiệm
3 g trái cây được cân và thái nhỏ, cho vào cối sứ, 20 ml HCl 1% sau đó được cho vào và ngâm khoảng 10 phút. Dịch ngâm sau khi lọc ra được giữ lại trong cốc; phần thịt được nghiền mịn, chuyển sang bình định mức 100 ml cùng với dung dịch HCl 1% vừa chiết ra. Cối và dụng cụ được tráng 3 lần với 1 ít acid oxalic 1%, tất cả được cho vào bình định mức. Sau đó, dung dịch được đưa lên thể tích 100 ml bằng acid oxalic. Tác dụng của HCl và acid oxalic trong thí nghiệm này là tạo môi trường ổn định cho vitamin C. Sau khi lắc kỹ, hỗn hợp dung dịch được để yên 15 phút rồi được lọc qua giấy lọc.
Chuẩn độ mẫu đối chứng: hỗn hợp 8 ml acid oxalic 1% và 2 ml HCl 1%
được cho vào bình tam giác dung tích 100 ml, sau đó được chuẩn độ bằng cách dùng microburet với 2,6 diclorophenol indophenol 0,001M đến lúc xuất hiện màu hồng bền sau 1 phút. Thể tích 2,6 diclorophenol indophenol dùng để chuẩn độ được ghi lại sau 3 lần lặp lại thí nghiệm để lấy kết quả trung bình.
Chuẩn độ mẫu thật: 10 ml dịch lọc được cho vào bình tam giác dung tích 100 ml và được tiến hành chuẩn độ như mẫu đối chứng.
xxxviii
Số mg vitamin C trong 100 g mẫu vật được tính như sau:
m v
V b
a
( ) 0,0088 100
a: số ml 2,6 diclorophenol indophenol trung bình khi định chuẩn mẫu vật
b: số ml 2,6 diclorophenol indophenol trung bình khi định chuẩn mẫu đối chứng 0,0088: số mg acid ascorbic tương đương với 1 ml dung dịch chuẩn 2,6 diclorophenol indophenol
V: thể tích dịch chiết ban đầu (100 ml)
v: thể tích dịch chiết lấy để định chuẩn (10 ml) m: trọng lượng mẫu vật cân ban đầu (3 g)
Việc chuẩn bị mẫu vật, cân mẫu vật, cắt mẫu vật (bằng dao inox) và nghiền mẫu vật cần được tiến hành nhanh chóng vì vitamin C rất dễ bị oxy hóa trong không khí, nhất là khi có sự hiện diện của các ion kim loại (Fe, Cu). Sản phẩm có chứa Fe2+, Sn2+, Cu2+ sẽ cho kết quả không chính xác.
Có thể kiểm tra sự hiện diện của các ion khử này ở nồng độ đủ để làm sai kết quả thí nghiệm bằng cách:Thêm 2 giọt dung dịch xanh methylen 0,05% vào 10 ml hỗn hợp (gồm 5 ml dịch chiết và 5 ml HCl 1%). Lắc đều, nếu dung dịch xanh methylen bị mất màu trong 5-10 giây cho thấy có sự hiện diện của các chất có tính khử trên.
Sn2+ không cho phản ứng với xanh methylen, có thể được thử nghiệm bằng cách cho 12 ml dung dịch HCl: nước (tỉ lệ 1:3) vào 12 ml dung dịch chiết. Thêm vào đó 5 giọt dung dịch Carmin indigo 0,05%. Khuấy đều, nếu dung dịch bị mất màu trong 5-10 giây cho thấy sự hiện diện của Sn2+ hay những chất có tính khử khác nói trên.
xxxix 3. Kết quả và thảo luận
Kết quả thí nghiệm định lượng vitamin C trong các mẫu gồm cam sành, hạnh, bưởi và chanh được trình bày trong Bảng 3 và Bảng 4.
Bảng 3: Thể tích 2,6 diclorophenol indophenol (ml) sau các lần định phân.
Bảng 4: Khối lượng vitamin C có trong mẫu vật.
Mẫu
Khối lượng vitamin C (mg/100g FW)
Cam sành 20,83
Hạnh 39,31
Bưởi 105,3
Chanh 72,74
Ghi chú: mg/100 g FW: số mg vitamin C trong 100 g trọng lượng tươi.
Kết quả kiểm tra sự hiện diện của các ion khử: dung dịch xanh methylen và carmin indigo không bị mất màu trong 5-10 giây cho thấy không có sự hiện diện của các chất có tính khử.
Mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Đối chứng 0,2 0,2 0,25 0,22
Cam sành 1 0,8 1 0,93
Hạnh 1,52 1,56 1,6 1,56
Bưởi 3,85 3,81 3,76 3,81
Chanh 2,7 2,35 2,5 2,52
xl
Chất chỉ thị DCIP có khả năng chuyển màu khi pH của môi trường thay đổi từ kiềm sang acid, chất chỉ thị chuyển từ xanh sang hồng (DCIP có màu xanh trong môi trường kiềm và môi trường acid yếu có màu tím trong khoảng pH từ 4 đến 5 và có màu hồng ở pH < 4).
Khi phản ứng vitamin C mất electron, những electron này có tác dụng khử DCIP có màu xanh thành DCIPH có màu hồng và sau đó thành DCIPH2 không màu.
xli
Quá trình này có thể tóm tắt ở phản ứng sau và chi tiết phản ứng được trình bày trong Hình 17.
DCIP (màu xanh) + H+ DCPIPH (màu hồng) DCPIPH (màu hồng) + Vitamin C DCPIPH2 (không màu)
C O
C C C
O OH
H CH
HO
HO HO CH2
H
N
H H HO
H
C
C C C C C
H Cl H
C C C C
C C Cl +
C O
C C C
H O CH HO
O O
+ H
H H
HO H
C
C C C C C
H Cl
Cl
O
H HO CH2
C C
C C C C
H
OH N
Hình 17: Phản ứng oxy hóa khử giữa acid ascorbic và DCIP
Acid ascorbic (không màu)
2,6 diclorophenol indophenol (màu hồng)
Acid ascorbic (dạng oxy hóa, màu nâu)
2,6 diclorophenol indophenol (dạng khử, không màu)
xlii
PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
Đề tài đã thực hiện và hoàn chỉnh 5 bài thực hành cho môn học Thực tập Hóa sinh học (TN364), bao gồm các đơn vị bài: Carbohydrate, Lipid, Xác định hoạt tính của enzyme amylase, Phản ứng oxy hóa - khử, Định lượng vitamin C bằng phương pháp Muri. Trong đó, bài Phản ứng oxy hóa - khử là một bài mới được đưa vào giáo trình.
2. Đề nghị
Đề nghị sử dụng kết quả của đề tài trong quá trình dạy và học thực hành Hóa sinh học (TN364).
xliii
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Đỗ Quý Hai (Chủ biên), Nguyễn Bá Lộc, Trần Thanh Phong, Cao Đăng Nguyên (2004). Giáo trình Hóa sinh, NXB Đại học Huế.
Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chính, Ngô Đại Nghiệp (2004). Thực tập lớn Sinh hóa, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ CHí Minh.
Nguyễn Đức lượng (2004). Công nghệ enzyme, NXB Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
Nguyễn Hữu Chấn (chủ biên) (2000), Những vấn đề hóa sinh học hiện đại, Tập I, NXB Khoa học và kỹ thuật.
Nguyễn Nghiêm Luật (2003). Thực tập Hóa sinh, NXB Y Học.
Nguyễn Văn Mùi (2001). Thực hành Hóa sinh học, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
Nguyễn Quang Vinh, Bùi Phương Thuận, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Thực tập Hóa sinh học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
Phạm Thị Ánh Hồng, Nguyễn Thị Huyên, Trần Mỹ Quan (1999). Thực tập Sinh hóa cơ sở, Tủ sách Đại học Khoa học tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.
Phạm Thị Trân Châu, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên (2010). Hóa sinh học các chất phân tử lớn trong hệ thống sống, NXB Giáo dục Việt Nam.
Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1997). Hóa sinh học, NXB Giáo dục.
Trần Tố, Cù Thị Thúy Nga (2008). Giáo trình Sinh hóa học động vật, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
xliv Tiếng Anh
Ismail Hamad, Nazl Arda, Murat Pekmez, Semian Karaer, and Güler Temizkan (2010). Intracellular scavenging activity of Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid) in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, J Nat Sci Biol Med. 2010 Jul-Dec; 1(1): 16–21.
Jian-Ming Lu, a Peter H. Lin, Qizhi Yao and Changyi Chena (2010).
Chemicaland molecular machanisms of antioxidants: Experimental approaches and model systems, J Cell Mol Med. 2010 April; 14(4): 840–860.
Luz E. Palacios, Tong Wang (2005). Egg-yolk Lecithin Fractionation and Characterization, Department of Food Science and Human Nutrition, Iowa State University, Ames, Iowa 50011-1061
L. W. Bennett, R. W. Keirs, E. D. Peebles, and P. D. Gerard, 2007, Poultry Science Association Inc.
Pauline E. Nutter (1940). Depletion of Tissue Glycogen during Fasting and Fatigue and Partial Recovery without Food, Vepartnient of Vital Economics, University of Rochester, New York.
Phylip Molyneux (2004). The use of the stable free radical diphenylpicrhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 2004, 26(2) : 211-219
Preetee P. Aklujkar, Santosh N. Sankh and Akalpita U. Arvindekar, 2008. A Simplified Method for the Isolation and Estimation of Cell Wall Bound.
Glycogen in Saccharomyces cerevisiae, The Institute of Brewing & Distilling.
S. Seifter, S. Dayton, B. Novic and E. Muntwyler (1949). The Estimation of Glycogen with the Anthrone Reagent, Department of Biochemistry, Long Island College of Medicine, Brooklyn, New York.
Sagar B. Kedare and R. P. Singh (2011). Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay, J Food Sci Technol. 2011 August; 48(4): 412–422.
xlv PHỤ LỤC
Chuẩn bị hóa chất, thuốc thử cho các bài thí nghiệm Bài 1: Carbohydrate
Hóa chất, thuốc thử
Cách chuẩn bị
KOH 30% Cân 30 g KOH cho vào bình định mức 100 ml, dùng nước cất đưa thể tích đến vạch.
Na2SO4
bão hòa
Cho Na2SO4 vào một lượng nước nhất định đến khi không còn tan được nữa.
H2SO4 5N Cho 46 ml H2SO4 đậm đặc (98%, d = 1,84 g/ml) vào bình định mức 100 ml, dùng nước cất đưa lên thể tích đến vạch.
NaOH 5N Cân 20 g NaOH cho vào bình định mức 100 ml, dùng nước cất đưa thể tích đến vạch.
Dung dịch Lugol
Hòa tan 0,25 g KI trong 1 ml nước cất, cho tiếp 0,1 g I2 vào, khuấy đều. Dùng nước đưa lên thể tích 10 ml. Bảo quản trong tối.
Thuốc thử Fehling
Dung dịch A: 4 g CuSO4 + 100 ml H2O
Dung dịch B: 2 g KNaC4O6.4H2O + 1,5 g NaOH + 10 ml H2O Khi sử dụng lấy dung dịch A trộn với dung dịch B theo tỉ lệ 1:1.
xlvi Bài 2 Lipid
Hóa chất, thuốc thử
Cách chuẩn bị
NaOH 10%
Cân 10 g NaOH cho vào bình định mức 100 ml, dùng nước cất đưa thể tích đến vạch.
H2SO4
10%
Cho 5,55 ml H2SO4 đậm đặc (98%, d =1,84 g/ml) vào bình định mức 100 ml, dùng nước cất đưa thể tích đến vạch.
Dung dịch molypden
Hỗn hợp gồm 7,5 g amoni molypdate, 40 ml nước cất, 50 ml acid nitric đặc.
Bài 3 Xác định hoạt tính của enzyme amylase
Hóa chất Thuốc thử
Cách chuẩn bị
Hồ tinh bột 1%
Cân 1g tinh bột hòa tan vào một ít nước cất, thêm 10 ml nước nóng, đun sôi và khuấy đều cho tan hết, lọc và thêm NaCl bão hòa cho đến 100 ml.
HCl 0,1N Cho 8,2 ml HCl đặc (37%, d = 1,19 g/ml) vào bình định mức 100 ml, dùng nước cất đưa thể tích đến vạch.
I2 gốc Hòa tan 0,5 g I2 và 5 g KI trong 1 lượng nhỏ nước, lắc nhẹ.
Cho nước cất lên đến 200 ml.
I2 phân tích Pha loãng 2 ml I2 gốc bằng dd HCl 0,1N trong bình định
xlvii
mức 100 ml. Đo OD ở 453 nm là 0,16. Nếu sai lệch thì hiệu chỉnh bằng cách thêm vài giọt dung dịch I2 gốc.
xlviii Bài 4 Phản ứng oxy hóa - khử
Hóa chất Thuốc thử
Cách chuẩn bị
Trolox 40 mM (10 mg/ml)
Cân 0,01 g trolox, hòa tan với 1 ml ethanol tuyệt đối, trữ ở 4C.
DPPH 6.10-2 M Cân 0,024 g DPPH, hòa tan với 1 ml ethanol tuyệt đối, trữ trong tối ở nhiệt độ phòng.
Bài 5 Định lượng vitamin C theo phương pháp Muri
Hóa chất, thuốc thử
Cách chuẩn bị
HCl 1% Cho 2,3 ml HCl đậm đặc (37%, d =1,19 g/ml) vào bình
định mức 100 ml, dùng nước cất đưa thể tích lên vạch.
Acid oxalic 1% Cho 1,4 g acid oxalic vào bình định mức 100 ml, dùng nước cất đưa thể tích đến vạch.
2,6 diclorophenol indophenol 0,001 M
Cho 0,168 g 2,6 diclorophenol indophenol vào bình định mức 500 ml dùng nước cất đưa thể tích đến vạch.
Dung dịch xanh
methylen 0,05% Cân 0,005 g xanh methylen hòa tan với 10 ml nước cất.
Dung dịch carmin
indigo 0,05% Cân 0,005 g carmin indigo hòa tan với 10 ml nước cất.