1.4.1. Hình dạng và kích thước
Protein cú kh ố i l ượ ng phõn t ử l ớ n t ừ hàng ch ụ c ủế n hàng tr ă m nghỡn Dalton. Kh ố i l ượ ng c ủ a m ộ t s ố protein ủượ c gi ớ i thi ệ u ở b ả ng 1-2.
ðể xỏc ủị nh kh ố i l ượ ng phõn t ử protein, Sverbergs, 1923 ủ ó ủề ngh ị s ử d ụ ng ph ươ ng phỏp siờu ly tõm.
D ự a vào t ố c ủộ k ế t l ắ ng c ủ a cỏc phõn t ử protein d ướ i tỏc d ụ ng c ủ a l ự c tr ọ ng tr ườ ng cú th ể tớnh ủượ c kh ố i l ượ ng phân t ử c ủ a chúng.
V ề m ặ t hỡnh d ạ ng, protein ủượ c hai thành hai lo ạ i: protein hỡnh s ợ i và protein hỡnh c ầ u.
Protein d ạ ng s ợ i: trong lo ạ i protein này, các chu ỗ i polypeptid phân b ố song song theo m ộ t tr ụ c t ạ o thành cỏc s ợ i dài ho ặ c cỏc l ớ p. Protein d ạ ng s ợ i là ph ầ n t ử c ấ u trỳc c ơ b ả n c ủ a ủộ ng v ậ t b ậ c cao nh ư collagen c ủ a gõn và mụ x ươ ng, α -keratine c ủ a lụng, túc, s ừ ng, múng vu ố t. Cỏc protein d ạ ng s ợ i t ươ ng ủố i tr ơ v ề m ặ t hóa h ọ c, ch ủ y ế u có ch ứ c n ă ng c ơ h ọ c.
Protein hình c ầ u: trong lo ạ i protein này, các chu ỗ i polypeptid cu ố n l ạ i v ớ i nhau thành c ấ u trúc hình c ầ u.
H ầ u h ế t cỏc protein hỡnh c ầ u tan trong n ướ c ho ặ c dung d ị ch mu ố i loóng. Nh ữ ng protein này ủả m b ả o
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Hoỏ sinh ủại cương...……… ………27
ch ứ c n ă ng ho ạ t ủộ ng cho t ế bào. H ầ u h ế t cỏc enzyme, cỏc t ế bào, m ộ t s ố cỏc hormon, albumine huy ế t thanh, hemoglobine ủề u là protein hỡnh c ầ u.
Bảng 1-2. Khối lượng phõn tử của một số protein ủiển hỡnh (Ngụ Xuõn Mạnh, 2006) Protein Kh ố i l ượ ng phân t ử
(Da)
S ố g ố c aminoacid
S ố chu ỗ i polypepti ủ e Insulin (bò)
Cytochrome c (ng ườ i) Ribonuclease A (bò) Lysosyme (tr ứ ng) Myoglobine (tim) Chymotrypsine (bò) Chymotripsinogen (bò) Hemoglobine (ng ườ i) Hexokinase (n ấ m men) Immunoglobuline G (ng ườ i) Polymerase (E.coli)
Apolypoprotein (ng ườ i) Glutamate dehydrogenase (bò)
5.733 13.000 13.700 13.930 16.890 21.600 22.000 64.500 102.000 145.000 450.000 513.000 1.000.000
51 104 124 129 153 241 245 574 800 1.320 4.100 4.350 8.300
2 1 1 1 1 3 1 4 2 4 5 1 40 1.4.2. Tính chất lưỡng tính
Protein có tính ch ấ t l ưỡ ng tính do nó ch ứ a các nhóm phân c ự c (amin và carboxyl) ở m ạ ch bên R c ủ a các aminoacid. Tùy thu ộ c vào s ố l ượ ng aminoacid ki ề m tính, acid tính và pH c ủ a môi tr ườ ng mà protein tớch ủ i ệ n õm hay d ươ ng và khi ủạ t nú trong ủ i ệ n tr ườ ng nú s ẽ d ị ch chuy ể n v ề c ự c d ươ ng hay c ự c âm.
pH th ấ p Protein tớch ủ i ệ n d ươ ng Có kh ả n ă ng nh ậ n proton nên là m ộ t base
Trong ủ i ệ n tr ườ ng di chuy ể n v ề c ự c âm
pH cao Protein tớch ủ i ệ n õm Có kh ả n ă ng cho proton nên là m ộ t acid
Trong ủ i ệ n tr ườ ng di chuy ể n v ề c ự c d ươ ng Nh ư v ậ y khi ủặ t protein trong ủ i ệ n tr ườ ng, tựy thu ộ c vào pH c ủ a mụi tr ườ ng mà protein s ẽ d ị ch chuy ể n v ề c ự c õm hay c ự c d ươ ng. Cú m ộ t giỏ tr ị pH t ạ i ủ ú protein khụng d ị ch chuy ể n trong ủ i ệ n tr ườ ng, t ổ ng ủ i ệ n tớch d ươ ng b ằ ng t ổ ng ủ i ệ n tớch õm hay phõn t ử protein lỳc ủ ú trung hũa v ề ủ i ệ n. Giỏ tr ị pH ủ ú ủượ c g ọ i là ủ i ể m ủẳ ng ủ i ệ n c ủ a protein và ủượ c ký hi ệ u là pI.
- H+
+ H+
- H+
+ H+
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Hoỏ sinh ủại cương...……… ………28
Cỏc protein khỏc nhau thỡ cú ủ i ể m ủằ ng ủ i ệ n khỏc nhau. Giỏ tr ị ủẳ ng ủ i ệ n c ủ a protein ph ụ thu ộ c vào s ố l ượ ng aminoacid ki ề m tính và acid tính c ấ u t ạ o nên chúng. Protein có nhi ề u aminoacid acid tính có pI t ạ i vùng acid và ng ượ c l ạ i. Pepsin có pI = 1 và Trypsin có pI = 10.5.
Ở mụi tr ườ ng cú pH = pI, protein d ễ dàng k ế t t ụ l ạ i v ớ i nhau do ủ ú cú th ể s ử d ụ ng tớnh ch ấ t này ủể xỏc ủị nh pI c ủ a protein c ũ ng nh ư ủể k ế t t ủ a protein. Thờm vào ủ ú, do s ự sai khỏc v ề pI gi ữ a cỏc protein khỏc nhau nờn cú th ể ủ i ề u ch ỉ nh pH c ủ a mụi tr ườ ng ủể tỏch protein ra kh ỏ i h ỗ n h ợ p c ủ a chỳng.
1.4.3. Tính chất bị biến tính a. Khái niệm về biến tính
D ướ i tỏc d ụ ng c ủ a cỏc tỏc nhõn v ậ t lý (nhi ệ t ủộ , tia UV, súng siờu õm, khu ấ y c ơ h ọ c...) ho ặ c cỏc tỏc nhõn húa h ọ c (acid m ạ nh, ki ề m m ạ nh, mu ố i c ủ a kim lo ạ i n ặ ng, tanin...), protein b ị bi ế n ủổ i cỏc c ấ u trỳc b ậ c hai, ba, b ố n và m ấ t ủ i cỏc tớnh ch ấ t ban ủầ u. Hi ệ n t ượ ng này ủượ c g ọ i là s ự bi ế n tớnh protein.
Th ị t, tr ứ ng sau khi gia nhi ệ t thỡ b ị ủặ c l ạ i hay lũng tr ắ ng tr ứ ng khi b ị khu ấ y thỡ t ạ o thành kem là cỏc vớ d ụ v ề s ự bi ế n tính protein.
Có hai lo ạ i bi ế n tính là bi ế n tính thu ậ n ngh ị ch và bi ế n tính không thu ậ n ngh ị ch. Bi ế n tính thu ậ n ngh ị ch là lo ạ i bi ế n tớnh mà sau khi lo ạ i ủ i y ế u t ố gõy bi ế n tớnh, protein quay tr ở l ạ i tr ạ ng thỏi ban ủầ u, cỏc tớnh ch ấ t ban ủầ u c ủ a nú ủượ c khụi ph ụ c. Bi ế n tớnh thu ậ n ngh ị ch ch ỉ x ả y ra n ế u s ử d ụ ng cỏc tỏc nhõn bi ế n tớnh nh ẹ nhàng nh ư acid, ki ề m ở n ồ ng ủộ th ấ p ho ặ c nhi ệ t ủộ th ấ p (b ả o qu ả n nụng s ả n ở nhi ệ t ủộ th ấ p).
Bi ế n tớnh khụng thu ậ n ngh ị ch là bi ế n tớnh mà sau khi lo ạ i ủ i y ế u t ố gõy bi ế n tớnh, protein khụng quay tr ở l ạ i ủượ c tr ạ ng thỏi ban ủầ u, cỏc tớnh ch ấ t ban ủầ u c ủ a nú khụng ủượ c khụi ph ụ c. Albumin làng tr ắ ng tr ứ ng b ị ủ ụng t ụ khi ủ un núng ở nhi ệ t ủộ 100°C; albumin, globulin c ủ a h ạ t ủậ u t ươ ng b ị k ế t t ủ a d ướ i tỏc d ụ ng c ủ a pH, nhi ệ t ủộ nh ấ t ủị nh khi làm ủậ u ph ụ là cỏc vớ d ụ v ề bi ế n tớnh khụng thu ậ n ngh ị ch.
Tính ch ấ t c ủ a protein khi b ị bi ế n tính:
- ủộ hũa tan c ủ a protein gi ả m do b ị l ộ cỏc nhúm k ỵ n ướ c - m ấ t ho ạ t tính sinh h ọ c
- t ă ng ủộ nh ạ y ủố i v ớ i s ự t ấ n cụng c ủ a cỏc enzyme protease do làm xu ấ t hi ệ n cỏc liờn k ế t peptide ứ ng v ớ i cỏc vựng t ấ n cụng ủặ c hi ệ u c ủ a enzyme.
- t ă ng ủộ nh ớ t n ộ i t ạ i - m ấ t kh ả n ă ng k ế t tinh.
b. Các yếu tố gây biến tính - Nhi ệ t ủộ :
Nhi ệ t ủộ là tỏc nhõn gõy bi ế n tớnh th ườ ng g ặ p nh ấ t. D ướ i tỏc d ụ ng c ủ a nhi ệ t ủộ cao, cỏc liờn k ế t b ị ủứ t ra, phõn t ử protein b ị gión m ạ ch, m ấ t ủ i c ấ u trỳc và ch ứ c n ă ng ban ủầ u ủặ c bi ệ t là ch ứ c n ă ng sinh h ọ c.
Cỏc protein-enzyme th ườ ng b ị bi ế n tớnh và m ấ t ủ i kh ả n ă ng xỳc tỏc ở nhi ệ t ủộ cao h ơ n 70°C.
Nhi ệ t ủộ th ấ p c ũ ng làm bi ế n tớnh protein: Nhi ề u enzyme b ề n ở nhi ệ t ủộ th ườ ng nh ư ng b ị vụ ho ạ t khi ở nhi ệ t ủộ 0°C. Protein c ủ a tr ứ ng, s ữ a th ườ ng b ị t ậ p h ợ p và k ế t t ủ a ở nhi ệ t ủộ l ạ nh ủ ụng.
Các protein ở tr ạ ng thái khô th ườ ng b ề n v ớ i bi ế n tính nhi ệ t. Các protein có t ỷ l ệ aminoacid k ỵ n ướ c/aminoacid ư a n ướ c cao thỡ d ễ b ị bi ế n tớnh ở nhi ệ t ủộ th ấ p.
- pH quá cao và quá th ấ p
Ph ầ n l ớ n protein b ị bi ế n tớnh t ạ i cỏc pH quỏ cao ho ặ c quỏ th ấ p. Cỏc pH c ự c tr ị này t ạ o ra l ự c ủẩ y t ĩ nh ủ i ệ n gi ữ a cỏc nhúm b ị ion húa do ủ ú làm gión m ạ ch phõn t ử protein.
- Các ion kim lo ạ i
Cỏc ion kim lo ạ i n ặ ng (Cu++, Fe++, Hg++, Ag+) ph ả n ứ ng nhanh v ớ i protein t ạ o ph ứ c trong ủ ú cú nh ữ ng ion t ạ o ph ứ c b ề n v ớ i nhóm thiol.
- Các dung môi h ữ u c ơ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Hoỏ sinh ủại cương...……… ………29
Ph ầ n l ớ n cỏc dung mụi h ữ u c ơ là cỏc tỏc nhõn bi ế n tớnh protein. Cỏc dung mụi h ữ u c ơ làm thay ủổ i h ằ ng s ố ủ i ệ n mụi c ủ a mụi tr ườ ng do ủ ú làm bi ế n ủổ i cỏc l ự c t ĩ nh ủ i ệ n v ố n làm b ề n phõn t ử protein. Cỏc dung môi h ữ u c ơ không c ự c c ũ ng có th ể xâm nh ậ p vào các vùng k ỵ n ướ c, phá v ỡ các t ươ ng tác k ỵ n ướ c do ủ ú làm bi ế n tớnh protein.
- X ử lý c ơ h ọ c
Các x ử lý c ơ h ọ c nh ư nhào tr ộ n ho ặ c cán b ộ t m ỳ t ạ o ra các l ự c c ắ t làm bi ế n tính protein. ðộ ng tác kéo ủ i kộo l ạ i nhi ề u l ầ n c ũ ng làm bi ế n tớnh protein do phỏ h ủ y cỏc xo ắ n α .
- Các tia b ứ c x ạ
Cỏc tia c ự c tớm b ị h ấ p th ụ b ở i cỏc g ố c aminoacid th ơ m do ủ ú cú th ể d ẫ n ủế n làm bi ế n ủổ i hỡnh th ể và n ế u m ứ c n ă ng l ượ ng ủủ l ớ n cú th ể làm ủứ t c ầ u disulfide.
Cỏc b ứ c x ạ c ủ a tia γ và cỏc tia ion húa c ũ ng làm bi ế n ủổ i hỡnh th ể , oxi húa m ộ t s ố g ố c aminoacid, phỏ h ủ y c ầ u ủồ ng húa tr ị , ion húa và t ạ o thành cỏc g ố c protein t ự do, c ũ ng nh ư tỏi t ổ h ợ p và trựng h ợ p protein.
Cỏc y ế u t ố làm bi ế n tỡnh protein th ườ ng ủượ c s ử d ụ ng ủể lo ạ i b ỏ protein ra kh ỏ i dung d ị ch, làm ng ừ ng ph ả n ứ ng enzyme. Cỏc ph ươ ng phỏp cú th ể dựng là ủ un sụi dung d ị ch protein; dựng cỏc húa ch ấ t làm bi ế n tính nh ư các acid trichloroacetic, acid volframic, acid picric, acid sulfosalicilic; dùng mu ố i c ủ a các kim lo ạ i n ặ ng Pb, Hg, Cu, Fe.
1.4.4. Cỏc phản ứng ủặc trưng a. Phản ứng Biure
Là ph ả n ứ ng ủặ c tr ư ng cho liờn k ế t peptide. T ấ t c ả cỏc peptide cú t ừ hai liờn k ế t peptide tr ở lờn ủề u cho ph ả n ứ ng này.
C ơ ch ế c ủ a ph ả n ứ ng: trong môi tr ườ ng ki ề m m ạ nh, các liên k ế t peptide trong phân t ử protein ph ả n ứ ng v ớ i CuSO4 t ạ o thành ph ứ c ch ấ t màu tím xanh (Hình 1-17).
Ph ứ c ch ấ t màu h ấ p th ụ c ự c ủạ i t ạ i b ướ c súng 540nm. C ườ ng ủộ c ủ a ph ứ c ph ụ thu ộ c vào n ồ ng ủộ protein và n ồ ng ủộ Cu++. Ph ả n ứ ng này ủượ c ứ ng d ụ ng r ộ ng rói ủể phỏt hi ệ n và ủị nh l ượ ng protein.
b. Phản ứng Xanthoprotein
Ph ả n ứ ng này ủặ c tr ư ng cho cỏc aminoacid mang vũng th ơ m.
C ơ ch ế ph ả n ứ ng: d ướ i tỏc d ụ ng c ủ a HNO3 ủậ m ủặ c cỏc aminoacid mang vũng th ơ m c ủ a protein b ị nitro hóa t ạ o d ẫ n xu ấ t dinitro có màu vàng. Khi h ỗ bi ế n các dinitro t ạ o thành d ạ ng enol và trong môi tr ườ ng ki ề m s ẽ t ạ o mu ố i d ạ ng quinoid có màu da cam (Hình 1-18).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Hoỏ sinh ủại cương...……… ………30
Hình 1-17. Cơ chế phản ứng Biure
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Hoỏ sinh ủại cương...……… ………31