3.1 Địa điểm nghiên cứu
- Đề tài nghiên cứu đ−ợc thực hiện tại các địa điểm sau:
+ Phòng nghiên cứu Vi sinh vật, bộ môn Bệnh cây - Viện Bảo vệ thực vật. Phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh cây Nông d−ợc tr−ờng Đại học Nông nghiệp I - Hà nội.
+ Một số v−ờn trồng cây có múi tại Bắc quang- Hà giang và phụ cận.
+ V−ờn trồng giống cây có múi sạch bệnh của Viện Bảo vệ thực vật tại Bắc quang-Hà giang.
- Thời gian thực tập từ 1/ 1/2005 đến 1 / 6 / 2005.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
- Cây cam, quýt, trồng tại các cơ sở trên.
+ Tuổi cây từ 1 năm đến 6 năm tuổi.
+ Trên các giống cam quýt thí nghiệm: Cam Sành, , quýt Đỏ địa ph−ơng.
- Môi tr−ờng nuôi cấy: WA, PDA, PCA, Czapeck.
- Mẫu bệnh hại là mẫu bệnh thu thập ngoài đồng ruộng, mẫu bệnh còn t−ơi mới, có vết bệnh điển hình.
- Các dụng cụ thiết yếu trong phòng thí nghiệm: Hộp petri, que cấy nấm khuẩn, tủ định ôn, phòng nuôi cấy nấm, các loại cốc thuỷ tinh, ống đong, bình định mức, nồi hấp, tủ lạnh, kính hiển vi quang học .v.v.
3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu bệnh hại ngoài đồng 3.3.1 Điều tra thành phần bệnh hại ngoài đồng
3.3.1.1 Ph−ơng pháp điều tra
- Điều tra theo ph−ơng pháp của Viện Bảo vệ thực vật (1996 , 1998) + Điều tra mỗi v−ờn năm điểm, mỗi điểm ba cây, mỗi cây điều tra theo bốn h−ớng Đông, Tây, Nam, Bắc, mỗi h−ớng một cành, mỗi cành điều tra 30 lá ngẫu nhiên .
+ Quan sát triệu chứng bệnh trên cây có múi tại các cơ sở trên, đánh giá
mức độ phổ biến của bệnh trên ruộng điều tra.
+ Phân cấp bệnh trên lá (thân, quả) :
+ < 10 % số cây bị bệnh + + 10 % - 25 % số cây bị bệnh + + + > 25 % - 50 % số cây bị bệnh + + + + > 50 % cây bị bệnh 3.3.1.2 Ph−ơng pháp điều tra diễn biến bệnh
Điều tra định kỳ 15 ngày 1 lần, theo phương pháp năm điểm chéo góc , mỗi điểm lấy ba cây , mối cây điều tra theo bốn h−ớng Đông, Tây, Nam, Bắc, mỗi h−ớng lấy một cành, mỗi cành lấy 30 lá ngẫu nhiên .
3.3.2 Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển của bệnh Thán th−
3.3.2.1. Mức độ hại của bệnh thán th− ở một số vùng trồng cây cam quýt - Địa điểm điều tra chủ yếu là các v−ờn trồng cam quýt ở huyện Bắc quang – Hà giang và vùng phụ cận.
- Giống điều tra : Cam Sành, Quýt Đỏ địa phương.
* ảnh hưởng của giống và loại cây có múi đến bệnh Thán thư
- Giống thí nghiệm : Cam Sành chiết, cam Sành ghép, Quýt Đỏ địa ph−ơng.
- Mỗi công thức 15 cây .
- Đánh giá TLB % Và CSB % qua các kỳ điều tra .
* ảnh hưởng của tuổi cây đến bệnh thán thư
- Giống thí nghiệm : Cam Sành , ở các độ tuổi 1 năm đến 6 năm - Mỗi công thức 15 cây .
- Đánh giá TLB % Và CSB % qua các kỳ điều tra .
* ảnh hưởng của mật độ trồng đến bệnh thán thư
- Thí nghiệm với hai công thức .
+ Công thức 1 : Mật độ trồng th−a (4 x 5 m) . + Công thức 2 : Mật độ trồng dầy (3 x 3 m) .
- Giống thí nghiệm là Cam Sành . - Mỗi công thức 15 cây.
- Đánh giá TLB % và CSB % qua các kỳ điều tra .
* ảnh hưởng của biện pháp làm cỏ đối với bệnh thán thư
- Thí nghiệm với hai công thức . + Công thức 1 : Có làm cỏ . + Công thức 2 : Không làm cỏ .
- Giống thí nghiệm là Cam Sành . - Mỗi công thức 15 cây.
- Đánh giá TLB % và CSB % qua các kỳ điều tra .
* ảnh hưởng của liều lượng đạm đến bệnh thán thư
- Thí nghiệm với hai công thức .
+ Công thức 1 : L−ợng đạm là 350 kg / ha . + Công thức 2 : L−ợng đạm là 250 kg / ha . Đạm Urê 46 % Indonesia .
- Giống thí nghiệm là Cam Sành . - Mỗi công thức 15 cây .
- Đánh giá TLB % và CSB % qua các kỳ điều tra .
* ảnh hưởng của thuốc hoá học đến bệnh thán thư
- Thí nghiệm với bốn loại thuốc là Ridomil Gold 68WP, Score 250EC, Polyram 85DF, Funguran 80WP .
- Giống thí nghiệm là Cam Sành, Có năm công thức, mỗi công thức 15 cây.
+ Công thức 1 : thuốc Ridomil Gold 68WP 0,1% . + Công thức 2 : thuốc Score 250 EC 0,1 %.
+ Công thức 3 : thuốc Polyram 85DF 0,1 %.
+ Công thức 4 : thuốc Funguran 80WP 0,1 %.
+ Công thức 5 : đối chứng, phun nước l2.
- Thuốc đ−ợc phun bằng bình bơm tay 10 lít của Công ty Vật t− Bảo vệ thực vật 1, điều tra bệnh hại tr−ớc khi phun 1 ngày và điều tra sau khi phun 10 ngày, 20 ngày .
- Đánh giá TLB% và CSB % qua các kỳ điều tra .
3.4 Nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu bệnh hại trong phòng
3.4.1 Phân lập và nuôi cấy Vi sinh vật gây bệnh trên các môi tr−ờng nhân tạo
3.4.1.1 Phương pháp để ẩm
Sau khi điều tra thu thập mẫu bệnh (lá, thân, cành, quả) ngoài đồng ruộng chúng tôi chọn mẫu bệnh có triệu chứng điển hình rửa sạch đất cát, cắt thành mẫu thích hợp để trong hộp peri có lót giấy ẩm , để ở nhiệt độ thích hợp.
sau 2 – 3 ngày có độ ẩm thường xuyên, đem kiểm tra dưới kính hiển vi để xác
định sơ bộ tác nhân gây bệnh.
3.4.1.2 Ph−ơng pháp chế tạo môi tr−ờng
Trong quá trính nghiên cứu chúng tôi đ2 sử dụng các loại môi tr−ờng nhân tạo PDA, PCA, Czapeck, WA.
* Môi tr−ờng PDA Thành phần:
+ Khoai t©y: 200 gram.
+ Agar : 20 gram.
+ §−êng glucose : 20 gram.
+ N−íc cÊt : 1000 ml.
Cách chế tạo (1000 ml): Khoai tây gọt sạch vỏ, thái lát mỏng, đem đun sôi với nước cất 30 phút, sau đó lọc bằng vải mỏng qua phễu. Nước đ2 lọc cho thêm nước cất đủ 1000 ml đem đun sôi lại.
Cho vào lần lượt, Agar khuấy đều cho tan hết, sau đó đổ môi trường vào bình tam giác, hay ống nghiệm có đậy nút giấy bạc (bình tam giác, ống nghiệm, hộp peri đ2 đ−ợc rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 180oC trong hai giờ).
Sau đó đem khử trùng trong nồi hấp ở áp suất 1,5 atm (121oC) trong 30 phút.
Môi trường đ2 khử trùng dùng để phân lập hoặc nuôi cấy nấm, có thể bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ < 5 0C để sử dụng dần.
* Môi tr−ờng PCA Thành phần:
+ Khoai t©y: 15 gram.
+ Agar: 20 gram.
+ Cà rốt: 14 gram.
+ N−íc cÊt : 1000 ml.
Cách chế tạo (1000 ml): T−ơng tự nh− môi tr−ờng PDA.
* Môi tr−ờng Czapeck Thành phần:
+ §−êng Saccarose: 20 gram + NaNO3: 2 gram + KH2PO4: 1 gram + MgSO4: 0,5 gram + FeCl3: 0,01 gram
+ KCl: 0,5 gram
+ Agar: 20 gram
+ N−íc cÊt: 1000 ml
Cách chế tạo (1000 ml): Đong đủ 1000 ml nước cất đem đun sôi, rồi cho lần l−ợt các hoá chất đ2 đ−ợc cân đủ l−ợng vào, khuấy đều cho tan hết, sau đó đổ môi trường vào bình tam giác hay ống nghiệm có đậy nút gấy bạc (bình tam giác , ống nghiệm, hộp peri đ2 đ−ợc rửa sạch và sấy khô ở nhịêt độ 180 0C trong hai giờ). Rồi đem khử trùng trong nồi hấp , cách khử trùng t−ơng tự trong môi tr−ờng PDA.
* Môi tr−ờng WA
Thành phần:
+ Agar: 20 gram + N−íc cÊt: 1000 ml
Cách chế tạo: Đun tan Agar trong nước cất sau đó khử trùng. Cách làm t−ơng tự nh− các môi tr−ờng trên.
3.4.1.3 Ph−ơng pháp phân lập
Mẫu bệnh điển hình tươi mới ngoài đồng ruộng chúng tôi đem về phân lập và nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo trong phòng thí nhiệm để tạo
đ−ợc nguồn nấm thuần khiết (Isolate) làm vật liệu nghiên cứu.
- Cách phân lập mẫu bệnh:
+ Mẫu bệnh phân lập lấy từ các vết trên lá (thân, cành, quả) có triệu chứng điển hình còn tươi mới đem về phòng thí nghiệm rửa sạch đất bụi bằng n−ớc máy. dùng dao đ2 khử trùng cắt thành từng miếng nhỏ (0,2–0,3 cm).
Miếng cắt có phần mô khoẻ và mô bệnh, sau đó khử trùng trong dung dịch HgCl2 0,1 % trong 1 phút, (hoặc khử trùng miếng cắt bằng cồn 70 0C, trong 1 phút) tiếp tục rửa sạch lại bằng nước cất 2 đên 3 lần, rồi thấm khô bằng giấy lọc vô trùng. Dùng que cấy đ2 khử trùng (nhúng cồn đốt lên ngọn lửa) để nguội cấy mô bệnh lên môi tr−ờng nhân tạo. Toàn bộ quá trình phân lập đ−ợc thực hiện trong điều kiện vô trùng và cách ly ở tủ cấy (khi phân lập phải khử trùng que cấy và hé mở đĩa petri trên ngọn lửa đèn cồn).
Sau khi nấm mọc tiến hành cắt đầu sợi nấm cấy truyền sang các ống nghiệm khác từ 4–5 lần cho đến khi thu đ−ợc nguồn nấm thuần khiết (Isolate).
Quan sát đặc điểm hình thái, màu sắc sợi nấm, tản nấm và bào tử phân sinh, cành bào tử và các cấu trúc của nấm. Khi đ2 có nấm thuần khiết, tiến hành các thí nhiệm trong phòng.
3.4.2 Xác định nguyên nhân gây bệnh thán th− trên cây cam Sành
Sau khi đ2 tạo đ−ợc nguồn nấm thuần khiết (Isolate), chúng tôi tiến hành
các thí nhiệm lây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng.
- Từ các cây bị lây nhiễm bệnh nhân tạo hình thành triệu chứng rõ ràng, chúng tôi tiến hành phân lập lại mô bệnh trên môi tr−ờng nhân tạo (theo quy tắc Koch).
- Miêu tả, so sánh các đặc điểm về hình thái và màu sắc của sợi nấm, tản nấm, đĩa cành, kích thước đĩa cành và bào tử của nấm gây bệnh thán thư
trên cây cam Sành và nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán th−
trêm cây cam, quýt.
- Dựa vào các đặc điểm về hình dạng, màu sắc kích thước bào tử, đĩa cành, sợi nấm và tản nấm để xác định loài nấm gây bệnh thán th− trên cây cam Sành, (căn cứ vào các tài liệu phân loại của Barnett và Hunter (1998) {28}.
3.4.3 Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo với nấm Colletotrichum gloeosporioides Dụng cụ: Dao, kéo, bông thấm n−ớc, băng dính, n−ớc cất vô trùng, nguồn bào tử và cây khỏe.
Ph−ơng pháp: Tr−ớc khi lây, tiến hành cắt bông thành những miếng nhỏ (kích thước 30 x 50 mm) đặt lên băng dính. Sau đó tạo dung dịch bào tử trong nước cất vô trùng đảm bảo nồng độ 10 000 bào tử/ml (khoảng 200 bào tử/một quang tr−ờng kính hiển vi quang học). Tiếp theo dùng kim nhọn sát th−ơng nhẹ tại điểm cần lây rồi phun hoặc nhỏ dung dịch bảo tử lên bề mặt sát thương, ngay sau đó dán miếng bông đ2 thấm nước cất vô trùng vào vị trí lây.
Với lây không sát th−ơng chúng tôi tiến hành các b−ớc t−ơng tự nh−ng không tạo nên vết th−ơng cơ giới.
Chỉ tiêu theo dõi: số lá (quả) lây bệnh, số lá (quả) phát bệnh, ngày lây bệnh, ngày phát bệnh, tính TLB % và thời kỳ tiềm dục ( ngày), mô tả triệu chứng bệnh.
Mỗi công thức lây 20 lá (9 quả).
Công thức đối chứng. 20 lá (9 quả) lây bằng nước cất vô trùng.
3.4.4 ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự sinh tr−ởng của sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides
- Sử dụng các nguồn nấm thán th− thuần khiết (isolate). Cấy nấm vào giữa hộp petri (đường kính lỗ đục 5 mm) trên các môi trường PCA, PDA, Czapeck.
Mỗi môi tr−ờng có ba lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 3 hộp petri.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Hình thái , màu sắc tản nấm.
+ Đo đ−ờng kính tản nấm sau cấy 2, 4, 6, 8 ngày.
+ Đơn vị đo (mm).
3.4.5. ảnh hưởng của các môi trường dinh dưỡng khác nhau đến kích th−ớc bào tử Colletotrichum gloeosporioides
Dùng nguồn nấm thuần khiết (Isolate), cấy vào giữa các hộp petri có chứa các môi trường khác nhau (đường kính lỗ đục 5 mm).
+ Công thức 1: Môi tr−ờng PCA + Công thức 2: Môi tr−ờng PDA.
+ Công thức 3: Môi tr−ờng Czapeck.
Mỗi công thức có ba lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 3 hộp petri.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Thời gian xuất hiện bào tử nấm (ngày).
+ Đo chiều dài, chiều rộng của các bào tử, mỗi công thức đo 100 bào tử.
+ Đơn vị đo: àm + Công thức tính.
Chiều dài (rộng) của bào tử = a x 1,2 (àm)
a = chiều dài (rộng) đo đ−ợc bằng th−ớc đo của trắc vị thị kính.
3.4.6 ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự hình thành bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm bằng nguồn nấm Colletotrichum gloeosporioides thuần khiết (Isolate), cấy vào các hộp petri (đ−ờng kính lỗ
đục 5 mm) với các môi trường khác nhau.
+ Công thức 1: Môi tr−ờng PCA.
+ Công thức 2: Môi tr−ờng PDA.
+ Công thức 3: Môi tr−ờng Czapeck.
Mỗi công thức có ba lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 3 hộp petri.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Đếm mật độ bào tử trên các môi trường khác nhau sau 10 ngày, 15 ngày, 20 ngày cấy.
+ Đơn vị đo: số l−ợng bào tử/ml Công thức tính.
[ Mật độ bào tử ] =
400 .10 10 . 400
. 4 n
m
Trong đó:
m = số lượng bào tử đếm được/một quang trường kính hiển vi.
10n : độ pha lo2ng (= 2 lần).
3.4.7 ảnh hưởng của ánh sáng đến sự sinh trưởng của sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides .
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm bằng nguồn nấm Colletotrichum gloeosporioides thuần khiết (Isolate), cấy vào các hộp petri (đ−ờng kính lỗ
đục 5 mm) trên môi trường PDA.
+ Công thức 1: tối hoàn toàn.
+ Công thức 2: 1/2 ánh sáng + 1/2 tối.
Mỗi công thức có ba lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 3 hộp petri.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Đo kích thước của tản nấm sau cấy 2, 4, 6, 8 ngày, đếm mật độ bào tử sau 10 ngày, 15 ngày, 20 ngày cấy.
3.4.8 ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides
Chúng tôi sử dụng các nguồn nấm thuần khiết (Isolate) đ2 phân lập
được (lỗ đục 5 mm), cấy vào giữa các hộp petri có chứa môi trường PDA. Sau khi cấy, các hộp petri đ−ợc đặt ở các mức nhiệt độ khác nhau (nhờ tủ lạnh và tủ định ôn, tủ nuôi cấy).
Các ng−ỡng nhiệt độ thí nghiệm: 15oC, 20oC, 25oC, 30oC, 35oC.
Mỗi ng−ỡng nhiệt độ có ba lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại có ba hộp petri.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Đo đường kính tản nấm sau 2, 4, 6, 8 ngày cấy (đơn vị đo: mm)
3.4.9 ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh trưởng của sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides
Dùng NaOH hoặc axit HCL để điều chỉnh pH của môi trường PDA có các ng−ỡng pH khác nhau từ pH 4 đến pH 8.
+ Công thức 1: pH4.
+ Công thức 2: pH5.
+Công thức 3: pH6.
+ Công thức 4: pH7.
+ Công thức 5: pH8.
Cấy nguồn nấm thuần khiết (Isolate) với đường kính lỗ đục 5mm vào giữa các hộp petri có chứa môi tr−ờng PDA, với các ng−ỡng pH khác nhau.
Mỗi công thức có ba lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 3 hộp petri.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Đo đ−ờng kính tản nấm sau cấy 2, 4, 6, 8 ngày.
+ Đơn vị đo: mm.
3.4.10 ảnh h−ởng của một số chất hóa học tới sự sinh tr−ởng của sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides
Tính toán nồng độ (liều l−ợng) và cân đủ trọng l−ợng thuốc hoá học cần thí nghiệm cho từng công thức.
Sau đó đổ môi trường PDA đ2 khử trùng vào các bình tam giác có vạch
định mức để nguội dần.
Khi môi tr−ờng PDA đ2 nguội (60oC) tiến hành cho thuốc thí nghiệm vào bình (hoặc l−ợng dung dịch mẹ đ2 tính đủ cho từng công thức) lắc đều trong môi tr−ờng.
Sau đó đổ ra các hộp petri, để cho môi trường đông cứng, rồi cấy nguồn nấm thuần (Isolate) với đường kính lỗ đục 5 mm vào giữa hộp petri đó.
Các công thức thí nghiệm:
+ Công thức 1: Thuốc Ridomil Gold 68WP 0,1%.
+ Công thức 2: Thuốc Score 250 EC 0,1%.
+ Công thức 3: Thuốc Polyram 85DF 0,1%.
+ Công thức 4: Thuốc Funguran 80WP 0,1%.
+ Công thức 5: Đối chứng, không có thuốc.
Mỗi công thức có 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 3 hộp petri.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Đo đ−ờng kính tản nấm sau 2, 4, 6, 8 ngày.
+ Đơn vị đo: mm.
3.5 Các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá
3.5.1 Tính tỉ lệ bệnh(%)
TLB(%) = ×100 B A
TLB: Tỷ lệ bệnh đ−ợc tính bằng (%) A: số lá (quả) bị bệnh
B: Tổng số lá (quả) điều tra 3.5.2 Chỉ số bệnh (%)
CSB (%) =
T N
b a
×
×
∑( × ) 100
CSB: Tổng tích số
a: số lá bị bệnh ở mỗi cấp.
b: Cấp bệnh t−ơng ứng.
T: Cấp bệnh cao nhất (cấp 5) N: Tổng số lá điều tra.
Bảng phân cấp bệnh lá:
+ Cấp 1: Vết bệnh < 5 % diện tích lá bị bệnh.
+ Cấp 2: Vết bệnh từ 5%-10% diện tích lá bị bệnh.
+ Cấp 3: Vết bệnh >10%-20% diện tích lá bị bệnh.
+ Cấp 4: Vết bệnh > 20%-30% diện tích lá bị bệnh.
+ Cấp 5: Vết bệnh > 30 % diện tích lá bị bệnh.
3.5.3 Độ hữu hiệu của thuốc hoá học trong phòng thí nhiệm (công thức Abbott)
§HH (%) = − ×100 C
T C
ĐHH (%): Độ hữu hiệu (%) của thuốc.
C: Mức độ bệnh (%) ở các công thức đối chứng sau xử lý. T: Mức
độ bệnh (%) ở công thức thí nghiệm sau xử lý.
Chú ý: Mức độ bệnh ở đây là CSB (%)
3.5.4 Độ hữu hiệu của thuốc hoá học ngoài đồng ruộng (công thức Henderson-Tiltion)
§HH (%) = (1 - )×100
×
×
C T
C T
a b
b a
ĐHH (%): Độ hữu hiệu của thuốc hoá học, tính bằng (%).
Ta: CSB (%) của công thức xử lý thuốc sau khi thí nghiệm.
Tb: CSB (%) của công thức xử lý thuốc tr−ớc khi thí nghiệm.
Ca: CSB (%) của công thức đối chứng sau khi thí nghiệm.
Cb: CSB (%) của công thức đối chứng trước khi thí nghiệm.
Đánh giá TLB (%) và CSB (%) với các bệnh hại bộ phận (cành lá), với các bệnh hại toàn cây nh− bệnh do vi khuẩn, virus chỉ đánh giá TLB (%).
Các số liệu thu đ−ợc xử lý theo ch−ơng trình thống kê IRRISTAT của Viện nghiên cứu lúa Quốc Tế.