Theo phương pháp lấy mẫu như trên tôi đã thu thập được 3 mẫu đất ở 3 độ sâu khác nhau trong khu vực đất đồi Đại Lải:
1. §é s©u 5cm 1. §é s©u 10cm 2. §é s©u 20cm
Sau khi thu mẫu tôi đã tiến hành xác định độ ẩm, độ pH của các mẫu
đất phân lập xạ khuẩn (theo phương pháp của Nguyễn Lân Dũng) tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa sinh- KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2. Căn cứ vào mật độ xạ khuẩn trong các mẫu, tôi chọn dịch đất có độ pha loãng 10-5 của các mẫu
đất để phân lập, mỗi mẫu đất đ−ợc phân lập trên 5 hộp petri. Sau 5- 7 ngày lấy ra quan sát những khuẩn lạc mọc đ−ợc trên giấy lọc tức có khả năng phân giải cellulose vì giấy lọc có cấu tạo từ cellulose, các VSV này đã tiết ra hệ enzym cellulose để đồng hoá nên phát triển đ−ợc trên giấy lọc.
Theo lý thuyết, trên môi tr−ờng Czapeck, cả xạ khuẩn, nấm mốc và một số vi khuẩn đều mọc. Nguyên nhân là các loại VSV này đều có khả năng phân giải cellulose. Nh−ng có thể phân biệt rõ ràng các khuẩn lạc này: khuẩn lạc vi khuẩn th−ờng nhày, −ớt và nhẵn; khuẩn lạc xạ khuẩn thì bông, xốp, khô, rắn chắc, xù xì, dạng da, dạng nhung, dạng phấn, tr−ờng hợp không có sợi khí sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo; khuẩn lạc của nấm mốc cũng có nhiều màu sắc nh− màu sắc khuẩn lạc của xạ khuẩn nh−ng khác ở chỗ nó phát triển nhanh hơn th−ờng to hơn khuẩn lạc xạ khuẩn nhiều lần, dạng xốp hơn do kích th−ớc sợi nấm to hơn. Th−ờng thì mỗi khuẩn lạc sau 3 ngày phát triển có kích thước 5-10mm, trong khi đó khuẩn lạc xạ khuẩn chỉ khoảng 0,5-2mm.
Đại học s− phạm Hμ Nội 2 K31B – Sinh24
Bảng 3.1. Sự phân bố của xạ khuẩn phân giải cellulose trong đất đồi Đại Lải
Tháng
§é s©u (cm)
§é Èm
%
pH
Số l−ợng khuẩn lạc trung bình trong 1 hép petri
Số l−ợng xạ khuÈn trong 1g đất khô
Số l−ợng xạ khuẩn trung b×nh
5 7,1 6,0 1 2,10.105
10 7,2 6,05 1 2,15. 105
8
20 7,3 6,05 1,3 2,56. 105
2,27. 105
5 7,6 6,1 1,2 2,56. 105
10 7,7 6,08 1,2 2,60. 105
9
20 7,9 6,1 1,3 3,02. 105
2,71. 105
5 8,1 6,2 1,4 3,45. 105
10 8,2 6,2 1,6 3,85. 105
10
20 8,3 6,2 1,8 4,26. 105
3,85. 105
Qua kết quả phân lập xạ khuẩn phân giải cellulose trong đất đồi Đại Lải
đ−ợc thống kê ở bảng 3.1 có thể rút ra một số nhận xét sau:
Sự phân bố của một số nhóm xạ khuẩn phân giải cellulose trong đất đồi
Đại Lải là rộng. Số l−ợng của các nhóm này trong 1g đất khô dao động từ 2,10.105- 4,26.105. Theo những kết quả nghiên cứu về xạ khuẩn đã đ−ợc khẳng định từ trước tới nay của nhiều tác giả trong và ngoài nước thì xạ khuẩn là VSV hoại sinh, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn là 25-300C, độ ẩm thích hợp từ 40-55%, độ pH trung tính hoặc kiềm nhẹ. Trên cơ sở này tôi phân tích lý giải sự khác nhau của mật độ xạ khuẩn phân giải cellulose trong các mẫu đất nh− sau:
Đất đồi Đại Lải là loại đất feralit đỏ vàng, bị xói mòn, rửa trôi mạnh, kết von và trơ đá. Loại đất này rất nghèo chất dinh d−ỡng, ít cây cối mọc
đ−ợc, chỉ có bạch đàn, keo lá tràm và một lớp cỏ mọc thấp, th−a thớt. Đất lại
Đại học s− phạm Hμ Nội 2 K31B – Sinh25
chua, độ pH = 6,0-6,2, độ ẩm cũng rất thấp (7,1-8,3). Những đặc điểm này không thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn đặc biệt là xạ khuẩn phân giải cellulose. Điều này phù hợp với kết quả phân lập chỉ có khoảng 2,94.105 mầm xạ khuẩn trong 1g đất khô. ở đất đồi Đại Lải hiện tượng số lượng xạ khuẩn ở lớp đất trên thấp hơn so với các lớp đất dưới, điều này có thể được giải thích như sau: ở lớp đất mặt thường có cường độ chiếu sáng liên tục và mạnh với các tia cực tím có khả năng diệt khuẩn mạnh. Đồng thời nhiệt độ cao cùng với trời m−a cũng cuốn trôi một phần xác hữu cơ làm giảm 1 phần độ màu mỡ của lớp đất bề mặt. ở lớp đất sâu cường độ ánh sáng yếu, nhiệt độ tương đối ổn định, xác hữu cơ được tích tụ và phân giải dưới tác
động của nhiều nhóm VSV trung gian tạo thành các chất hữu cơ trung gian và hàm l−ợng oxy hoà tan khá cao, thuận lợi cho sự sinh tr−ởng và phát triển của xạ khuẩn. Sau khi phân lập tôi đã thu đ−ợc các khuẩn lạc xạ khuẩn riêng biệt trên các hộp petri. Cho những khuẩn lạc mọc tốt, không bị nhiễm cấy truyền sang các ống thạch nghiêng chứa môi tr−ờng Czapeck – tinh bột. Nuôi cấy giữ
trong tủ ấm ở nhiệt độ 28-300C. Sau 5-7 ngày lấy ra quan sát, những ống nghiệm nào bị nhiễm, ch−a thuần chủng thì đ−ợc phân lập lại. Kết quả tôi thu
đ−ợc 11 mẫu xạ khuẩn từ 3 mẫu đất. Căn cứ vào màu sắc hệ sợi khí sinh của các chủng phân lập đ−ợc tôi chia thành 4 màu nh− sau:
Màu trắng: 5 mẫu chiếm 45,4%
Màu hồng: 2 mẫu chiếm 18,1%
Màu vàng: 3 mẫu chiếm 27,2%
Màu xanh: 1 mẫu chiếm 9%
Kết quả cho thấy: trong số 11 mẫu xạ khuẩn phân lập đ−ợc từ các mẫu
đất đồi Đại Lải thì số xạ khuẩn phân giải cellulose có màu trắng là cao nhất 5/11 mẫu, sau đó là các màu vàng 3/11 mẫu, màu hồng nhạt 2/11 mẫu, màu xanh có số mẫu thấp nhất 1/11. Đặc biệt các mẫu xạ khuẩn màu hồng có
Đại học s− phạm Hμ Nội 2 K31B – Sinh26
khuẩn lạc to hơn các mẫu khác chứng tỏ chúng có khả năng phân giải cellulose mạnh.
* Kiểm tra hoạt tính enzym của xạ khuẩn
Enzym ngoại bào là một yếu tố giúp VSV có khả năng tận dụng nguồn dinh dưỡng ngoài môi trường cho sinh trưởng và phát triển. Tôi đã tiến hành kiểm tra hoạt tính enzym ngoại bào của các chủng Micromonosprora phân lập bằng phương pháp chấm điểm trên môi trường Gause I có thay đổi nguồn C và N. Kết quả đ−ợc thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.2. Hoạt tính cellulose của 2 chủng xạ khuẩn chi Micromonospora phân lập được
Mức độ hoạt tính Chủng
Mạnh Rất mạnh Đ6.1 +
Đ6.4 +
Ghi chú :
+ Mạnh : 20mm≤ D- d< 30mm + Rất mạnh : D- d≥ 30mm Qua kết quả thu đ−ợc tôi thấy rằng:
Cỏc chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzym cellulase, chứng tỏ các chủng Micromonospora phân lập đ−ợc có khả năng sinh cả enzym endo glucanase và exo glucanase. Điều này có thể giải thích là do nguồn cacbon hữu cơ trong đất đồi Đại Lải chủ yếu là cellulose tự nhiên, có mức độ kết tinh cao khó phân giải. Để thích ứng với điều kiện đó, xạ khuẩn chi Micromonospora trong đất đồi đã phải thích nghi với hệ enzim tương ứng là exo glucanase tách những đơn vị cellobiose khỏi đầu không khử của chuỗi cellobiose. Tóm lại khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng xạ khuẩn chi Micromonospora phân lập từ đất đồi Đại Lải là khá tốt. Và tôi đã tuyển
Đại học s− phạm Hμ Nội 2 K31B – Sinh27
chọn ra 2 chủng là Đ6.1 và Đ6.4. Dựa vào thang màu chuẩn trong bảng màu Bondarsev (1954). Kết quả phân nhóm đ−ợc thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả phân nhóm xạ khuẩn chi Micromonospora phân lập từ đất
đồi Đại Lải
STT Tên chủng Màu sắc bào tử
Màu sắc hệ sợi cơ chất
Sắc tố tan
1 §6.1 §en Da cam _
2 §6.4 §en N©u ®en _