3.2.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh h−ởng đến khả năng sinh tổng hợp enzym của xạ khuẩn chi Micromonospora
Các yếu tố môi trường và nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng, phát triển của VSV. Do đó khả năng sinh enzym cũng chịu ảnh hưởng của các yếu tố này. Để xác định những điều kiện tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp enzym của xạ khuẩn chi Micromonospora, tôi đã tiến hành kiểm tra một số điều kiện: thời gian nuôi cấy, độ pH của môi trường, đến khả
năng sinh enzym cellulase của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn.
3.2.2. ảnh h−ởng của thời gian nuôi cấy
Xạ khuẩn đ−ợc nuôi cấy trong môi tr−ờng Gause I dịch thể trên máy lắc 160vòng/phút. Cứ sau 24h lấy ra li tâm thu dịch enzym thô. Kiểm tra hoạt lực cellulase bằng ph−ơng pháp khuếch tán trên thạch.
Kết quả đ−ợc thể hiện ở bảng 3.4.
Đại học s− phạm Hμ Nội 2 K31B – Sinh28
Bảng 3.4. ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulose của Micromonospora Đ6.1 và Đ6.4.
Chủng xạ
khuÈn §6.1 §6.4
Thêi gian (h)
CMC (D - d, mm)
BG (D - d, mm)
CMC (D - d, mm)
BG (D - d, mm)
24 14
TÝm ®Ëm
19 TÝm ®Ëm
15 TÝm ®Ëm
14 TÝm ®Ëm
48 16
Vàng nhạt
22 TÝm ®Ëm
17 Vàng nhạt
16 Vàng nhạt
72 18
Trong suèt
24 Vàng nhạt
17 Trong suèt
18 Trong suèt
96 22
Trong suèt
26 Trong suèt
20 Trong suèt
25 Trong suèt
120 25
Trong suèt
27 Trong suèt
24 Trong suèt
27 Trong suèt
144 25
Trong suèt
27 Trong suèt
23 Trong suèt
24 Trong suèt
168 21
Trong suèt
25 Trong suèt
21 Trong suèt
23 Trong suèt
192 20
Trong suèt
23 Trong suèt
20 Trong suèt
23 Trong suèt Ghi chó:
CMC: Cacboxyl metyl cellulose (nhËn biÕt enzym Cx) BG: Bột giấy lọc (nhận biết enzym C1)
D: Vòng phân giải cơ chất d: Đ−ờng kính xạ khuẩn
Đại học s− phạm Hμ Nội 2 K31B – Sinh29
Qua bảng 3.4 cho thấy thời gian càng dài thì khả năng sinh enzym càng tốt. Tôi nhận thấy rằng màu sắc vòng phân giải biến đổi theo thời gian, từ tím
đậm- tím nhạt- hồng nhạt- vàng nhạt và cuối cùng là trong suốt. Trong những ngày đầu vòng phân giải có màu tím đậm, điều đó có thể giải thích do nguyên nh©n chÝnh sau:
Ban đầu do quá trình sinh tr−ởng của xạ khuẩn đang ở pha tiềm phát (pha lag), do đó xạ khuẩn sinh trưởng chậm, số lượng tế bào nhỏ nên lượng enzym tiết ra ít chỉ có thể phân giải cellulose thành các oligosaccarit có khối l−ợng phân tử lớn nên vòng phân giải bắt màu tím đậm. Mặt khác do trong dịch nuôi cấy còn chứa nhiều tinh bột tan ch−a đ−ợc xạ khuẩn sử dụng hết.
Khi thử hoạt tính các phân tử tinh bột tan thấm ra xung quanh lỗ thạch sẽ bắt màu đậm với thuốc thử lugol.
Từ kết quả thu đ−ợc, tôi đã xây dựng đồ thị so sánh hoạt lực của 2 enzym C1 và Cx
0 5 10 15 20 25 30
1 2 3 4 5 6 7 8
Thời gian (ngày)
D-d,mm
CMC BG
Đồ thị 3.1. ảnh h−ởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng Đ6.1
Đại học s− phạm Hμ Nội 2 K31B – Sinh30
0 5 10 15 20 25 30
1 2 3 4 5 6 7 8
Thời gian (ngày)
D-d,mm
CMC BG
Đồ thị 3.2. ảnh h−ởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng Đ6.4
3.2.3. ảnh h−ởng của độ pH môi tr−ờng
Để nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH môi trường đến khả năng sinh enzym của xạ khuẩn chi Micromonospora. Tôi đã tiến hành nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường Gause I dịch thể đã được điều chỉnh pH ở các mức: 5,0;
5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N. Sau 5 ngày nuôi cấy, đem li tâm lấy dịch enzym thô, kiểm tra hoạt lực enzym bằng ph−ơng pháp khuếch tán trên thạch. Kết quả đ−ợc thể hiện ở bảng 3.5.
Đại học s− phạm Hμ Nội 2 K31B – Sinh31
Bảng 3.5. ảnh hưởng của độ pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của Micromonospora Đ6.1 và Đ6.4
Tên chủng Đ6.1 Đ6.4
§é pH CMC
(D - d, mm)
BG (D - d, mm)
CMC (D - d, mm)
BG (D - d, mm)
5,0
19 Tím nhạt
20 Tím nhạt
18 TÝm ®Ëm
20 tÝm ®Ëm
5,5 20
Trong suèt
21 Trong suèt
21 tím nhạt
19 Tím nhạt
6,0 23
Trong suèt
22 Trong suèt
23 Trong suèt
21 Trong suèt
6,5 24
Trong suèt
22 Trong suèt
25 Trong suèt
21 Trong suèt
7,0 26
Trong suèt
25 Trong suèt
25 Trong suèt
23 Trong suèt
7,5 25
Trong suèt
23 Trong suèt
24 Trong suèt
20 Trong suèt
8,0 22
Trong suèt
21 Trong suèt
22 Trong suèt
20 Trong suèt Qua bảng 3.5 thấy rằng:
Hai chủng xạ khuẩn nghiên cứu tổng hợp cellulase rất yếu ở mức pH 5,0 đến 5,5. ở điều kiện pH 6,0 đến 7,5 khả năng sinh enzym của 2 chủng xạ khuẩn là tốt, enzym sinh ra nhiều nhất ở pH = 7,0. Khi độ pH tăng lên, môi
Đại học s− phạm Hμ Nội 2 K31B – Sinh32
tr−ờng trở nên kiềm tính thì khả năng sinh enzym của 2 chủng xạ khuẩn cũng có xu h−ớng giảm dần.
Từ kết quả trên, tôi đã xây dựng đ−ợc đồ thị so sánh khả năng sinh enzym C1 và Cx của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu nh− sau.
0 5 10 15 20 25 30
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 pH
D-d, mm
CMC BG
Đồ thị 3.3. ảnh h−ởng của độ pH môi tr−ờng đến khả năng sinh cellulase của chủng Đ6.1
0 5 10 15 20 25 30
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 pH
D-d,mm
CMC BG
Đồ thị 3.4. ảnh h−ởng của độ pH môi tr−ờng đến khả năng sinh cellulase của chủng Đ6.4
Đại học s− phạm Hμ Nội 2 K31B – Sinh33