IV. TIẾN HÀNH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NGUYÊN LIỆU SỮA BÒ TƯƠI
2. Kiểm tra chất lượng sữa bò tươi
2.3. Phương pháp phân tích vi sinh
Để đánh giá độ nhiễm khuẩn chung của sữa, người ta sử dụng phản ứng reductaza, dựa trên cơ sở men reductaza do vi khuẩn sản sinh ra có khả năng oxy hóa hoàn nguyên, làm mất màu thuốc thử xanh methylen. Số lượng vi khuẩn có mặt trong sữa liên quan đến sự mất màu nhiều hay ít, nhanh hay chậm của xanh methylen được pha vào sữa.
Nguyên tắc :
Các vi khuẩn trong sữa sản sinh ra hydrogen, tham gia vào quá trình khử enzym một số thành phần trong sữa. Trong khi thêm xanh methylen là sản phẩm dễ bị khử và mất màu sau khử. Người ta đưa xanh methylen vào làm cơ chất cạnh tranh hydrogen.
Thiết bị, dụng cụ, hóa chất : - Ống nghiệm vô trùng
- Dung dịch xanh methylen (0, 005%) - Nồi cách thủy
Tiến hành :
Cho vào ống nghiệm vô trùng 1ml dung dịch xanh methylen (0, 005%) và thêm 9ml mẫu sữa.
Đậy nắp ống nghiệm, lắc nhẹ ống nghiệm bằng cách lặt đi lặt lại 2 lần. Đặt trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 37- 380C là thích hợp cho reductaza. Chú ý để mức nước bên ngoài ống nghiệm cao hơn mức nước sữa trong ống nghiệm. ở 38- 400C, nữa giờ lắc một lần và theo dõi thời gian mất màu của sữa. Sau khi nhiệt độ trong ống nghiệm đã đạt 38- 400C thì bắt đầu tính giờ. Cứ sau 30 phút lặc lại một lần, và xác định độ mất màu theo thời gian.
Kết quả :
Dựa vào thời gian mất màu của sữa, người ta phân loại chất lượng sữa theo phương pháp mất màu xanh methylen như sau:
Đánh giá mực độ ô nhiễm do vi sinh vật gây ra
Thời gian mất màu Trước 15 phút
15 phút - 1 giờ
1-3giờ Sau 3 giờ
Mức độ ô nhiễm
VSV Rất nặng Nặng Nhẹ Đạt tiêu chuẩn
vệ sinh
Thời gian mất màu xanh methylen tỉ lệ nghịch với số lượng vi khuẩn hoạt động trong sữa. Thông thường người ta lấy mốc thời gian mất màu trước và sau 3 giờ. Sau 3 giờ mất màu là sữa đạt tiêu chuẩn, và nếu mất màu trước nửa giờ chứng tỏ sữa kém chất phẩm.
Lưu ý: Không tính khoảng màu xanh trên mặt sữa khoảng 1cm do bị oxi hóa lại bởi không khí và ở đáy ống nghiệm khoảng 1cm
Nhận xét: Nếu sữa tốt thì lượng vi sinh vật trong sữa sẽ nhiều, lượng trao đổi chất càng nhiều. Vì vậy thời gian đổi màu càng nhanh.
2.3.2. Xác định Staphylococcus aureus
Nguyên tắc :
Dựa vào tính chất đặc biệt Staphylococcus aureus là phát triển trên môi trường muối mannol cũng như trên môi trường Chamma tạo khuẩn lạc màu vàng hoặc trên môi trường Baird-Packer cho khuẩn lạc màu đen.
Nếu sau khi nuôi cấy, không có khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch chọn lọc nói trên thì cũng chưa khẳng định là không có Staphylococcus aureus trong mẫu phân tích vi khuẩn này ở lượng rất nhỏ. Trong trường hợp này nên tăng lượng vi khuẩn này bằng cách nuôi cấy trên môi trường thạch Chamma chọn lọc. Như vậy, ta có thể xác định được số lượng ít nhất của Staphylococcus aureus trong thể tích sản phẩm ban đầu.
Thiết bị, dụng cụ, môi trường : - Dụng cụ chuẩn bị mẫu
- Tủ sấy, tủ hấp, tủ ấm, tủ lạnh - Cồn 700
- Cân kĩ thuật
- Đĩa petri, ống nghiệm - Pipet 2,5,10,50ml - Kéo, kẹp
- Môi trường Chapman lỏng (cực mặn) - Môi trường Chapman
- Môi trường đã được pha chế trước, cho vào ống nghiệm, tiệt trùng và đã được bảo quản trong tủ lạnh nếu chưa sử dụng ngay.
Cách tiến hành :
- Chuẩn bị mẫu thử để tạo thành một thể đồng nhất và pha loãng mẫu nếu thấy cần thiết.Trong trường hợp dự đoán là lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus ít khi có thể nuôi cấy tăng sinh như sau: lấy 1ml mẫu nguyên hay 1ml dịch huyền phù (nếu mẫu ở dạng rắn cho vào ống nghiệm có chứa 9ml môi trường Chapman lỏng và nuôi ở tủ ấm ở 370C trong 24h. Nếu nhìn thấy có sự phát triển của vi sinh vật thì tiếp tục các thí nghiệm tiếp theo.
- Cho 0,05 hoặc 1 giọt mẫu đã pha loãng hay mẫu đã qua nuôi cấy tăng sinh và cấy lên trên bề mặt thạch Chapman hoặc Baird-Parker
- Nuôi trong tủ ấm 370C trong 24-72h - Quan sát khuẩn lạc mọc trên đĩa
- Trên môi trường Chapman, đếm khuẩn lạc tròn, màu vàng, nhỏ
- Trên môi trường Baird-Parker đếm những khẩn lạc có màu đen bóng, có một mép viền màu trắng xám, xung quanh khuẩn lạc có một vòng sáng trong rộng.
Nếu kiểm tra các khuẩn lạc dưới kính hiển vi là vi khuẩn Gram +, tạo thành từng chùm như các chùm nho thì nghi ngờ có thể là Staphylococcus aureus và nên làm phản ứng sinh hóa coagulase để khẳng định.
Phép thử khẳng định bằng phản ứng đông huyết tương
Đây là phản ứng rất quan trọng để xác định Staphylococcus aureus. Cho vào ống nghiệm nhỏ 0,5ml huyết tương nhỏ, dùng que cấy cấy chuyền vi khuẩn từ những khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập. Lắc nhẹ cho hai môi trường trộn đều, để ở 370C, tiếp tục kiểm tra mẫu sau mỗi 2h. Mọi sự ngưng kết tạo thành một thể đông trong ống nghiệm gọi là dương tính. Nếu sau 4h phản ứng vẫn âm tính cần để ở 370C trong 24h để
phát hiện những chủng men glucose yếu. Tiếp tục nuôi cấy đến 24h thì ngưng nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ.
Nếu thực hiện thêm 2 thí nghiệm khác để đối chứng như sau:
Một ống đối chứng âm tính không có vi khuẩn mà chỉ cấy huyết tương với vài giọt nước cất tiệt trùng.
Một ống đối chứng đã cấy sẵn tụ cầu gây bệnh.
Kết quả :
- Sắp xếp thành chùm nho điển hình - Lên men đường manitol
- Đông huyết tương Công thức:
N= ∑C
n . f . v *R (CFU/ml, CFU/g)
Trong đó: ∑C : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa N : Nố đĩa đếm ở nồng độ pha loãng
F : Hệ số pha loãng của mẫu
V : Thể tích mẫu cấy vào mõi đĩa petri
R : Số ống thử phản ứng coaglutase dương tính/tổng số ống thử 2.3.3. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí sinh H2S
Nguyên tắc :
Là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí trên môi trường pepton với giấy chì axetat
Thiết bị, dụng cụ, môi trường : - Ống nghiệm, cân
- Môi trường pepton - Giấy chì axetat
Cách tiến hành :
- Pha loãng mẫu: Tùy theo mức độ nhiễm bẫn của sữa mà pha loãng dung dịch 1:10, 1:100
- Gieo cấy:
Dùng hai ống nước pepton có thêm 2ml Na2SO3 đặc: 1 ống 10ml sữa chưa pha loãng và 1 ống 1ml sữa chưa pha loãng
Dùng hai ống nước pepton khác có thêm 2ml Na2SO3 25%: 1 ống cấy 10ml mẫu pha loãng 1:10 và 1 ống cấy 1ml mẫu pha loãng 1:100
Trên mỗi ống đều treo một giấy chỉ axetat. Chỉ axetat có độc tính đối với vi khuẩn, vì vậy không nên để giấy chạm vào dịch nuôi.
Để ở 370C trong tủ ấm 48-72h. Nếu có vi khuẩn hiếu khí sinh H2S thì giấy tẩm chì axetat có màu đen.
Kết quả :
- Đối với mẫu trắng không xuất hiện khuẩn lạc, không bị đục, khôn tạo kết tủa, không sinh khí tạo bọt, không tạo màng là đạt yêu cầu.
- Đối với mẫu phân tích: xuất hiện một trong các hiện tượng trên. Sau đó ta đếm số lượng ống nghiệm dương tính ở mỗi nồng độ. Sau đó tra bảng và tính ra kết quả.