Thời gian: từ tháng 08/2014 đến tháng 11/2014.
Địa điểm: phòng thí nghiệm Sinh hóa và phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme thuộc Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Dụng cụ và thiết bị
Bộ micropipette Bio Rad P10 P20 P200 P1000 (USA), máy khuấy từ (USA), máy đo quang phổ Hitachi U-1500 (Nhật), tủ lạnh Hitsuji (Nhật), tủ lạnh đông Sanyo (Nhật), tủ lạnh -200C Electrolux Confor plus (Thụy Điển), pH kế Orion 420A (USA), bếp đung cách thủy, cân điện tử Startorius (Đức), cuvette thủy tinh, ống eppendorf, ống nghiệm và một số dụng cụ và vật liệu tiêu hao khác.
3.1.3. Nguyên vật liệu
Trứng gà Hisex Brown được mua từ trang trại của ông An. Địa chỉ: ấp Ngãi Hòa, xã Hòa Bình, huyện Trà Ôn, tỉnh Vĩnh Long.
Trứng gà Tam Hoàng được mua từ cửa hàng ông Nguyễn Văn On. Địa chỉ: 15F Phó Cơ Điều, phường 8, thành phố Vĩnh Long, tỉnh Vĩnh Long.
Trứng gà Ác và gà Ta được mua tại cửa hàng Hột Vịt Vũ Sò. Địa chỉ: chợ phường 1, thành phố Bạc Liêu, tỉnh Bạc Liêu.
Trứng gà Tre được mua từ hộ dân. Địa chỉ: số 1096, tổ 39, khu vực Lân Thạnh 1, phường Tân Lộc, quận Thốt Nốt, thành phố Cần Thơ.
Trứng gà Tàu Ri vàng và gà Isa Brown được mua từ Trung tâm giống Hậu Giang. Địa chỉ: 128 Quốc lộ 61, ấp 12, xã Vị Thắng, đường quốc lộ 1A, huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu Giang.
3.1.4. Hóa chất
Microccocus lysodeikticus đông khô (Sigma), Bovin Serum Albumin (Merck), Ethanol (Việt Nam), Phosphoric acid (Merck), Acrylamide (Bio Rad), β- mercaptoethanol (Merck), Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), Sodium Dedocyl Sulfate (Sigma), Sodium Chloride (Merck), di-Potassium hydrogenphosphate (Merck), Sodium dihydrogenphosphate (Merck), Tris (Merck), Coomassie Brilliant Blue G250
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 18 Viện NC & PT Công nghệ sinh học
(Merck), Acid chlohyride (Probalo), Ammonium persulfate (Bio Rad), Potassium hydroxide (Merck).
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly Lysozyme từ lòng trắng trứng gà
3.2.1.1. Thí nghiệm 1: Chọn nguồn trứng gà khác nhau để trích ly Lysozyme Mục đích: Xác định loại trứng gà có hoạt tính Lysozyme cao nhất và mang tính kinh tế từ các nguồn trứng gà khác nhau
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố (nguồn trứng gà) với 7 mức độ và 3 lần lặp lại.
Bảng 3: Các nguồn trứng gà khác nhau Nghiệm
thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7
Giống gà Gà Hisex Brown
Gà Tàu
Ri vàng Gà Ta Gà Ác Gà Tre Gà Isa Brown
Gà Tam hoàng
*NT: Nghiệm thức
Tiến hành thí nghiệm:
+ Mỗi loại trứng từ các giống gà khác nhau (bảng 3) được tách vỏ và lòng đỏ để thu nhận lòng trắng trứng.
+ Sử dụng lòng trắng trứng (3 trứng có khối lượng và kích thước) để trích ly Lysozyme.
+ Lòng trắng trứng được pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1 : 1, để trích ly Lysozyme ở nhiệt độ 40C trong 10 phút.
- Chỉ tiêu đánh giá:
+ Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (Phụ lục 1).
+ Hoạt tính Lysozyme bằng phương pháp Shugar (Phụ lục 1).
+ Hoạt tính đặc hiệu.
+ Hoạt tính tổng.
+ Protein tổng.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 19 Viện NC & PT Công nghệ sinh học
3.2.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát dung dịch đệm để trích ly Lysozyme Mục đích: Xác định dung dịch đệm thích hợp để trích ly Lysozyme.
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố (dung dịch đệm) với 5 mức độ và 3 lần lặp lại.
Bảng 4: Dung dịch đệm trích ly
*NT: Nghiệm thức
Tiến hành thí nghiệm:
+ Sử dụng trứng gà được xác định ở thí nghiệm 1 để trích ly Lysozyme.
+ Lấy lòng trắng trứng gà (3 trứng có khối lượng và kích thước) pha loãng với từng loại dung dịch đệm theo bảng 4.
+ Tỷ lệ lòng trắng trứng và dung dịch đệm là 1 : 1 ở nhiệt độ 40C trong 10 phút.
- Chỉ tiêu đánh giá:
+ Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (Phụ lục 1).
+ Hoạt tính Lysozyme bằng phương pháp Shugar (Phụ lục 1).
+ Hoạt tính đặc hiệu.
+ Hoạt tính tổng.
+ Protein tổng.
3.2.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát tỷ lệ giữa dung dịch đệm với lòng trắng trứng để trích ly Lysozyme
Mục đích: Xác định tỷ lệ dung dịch đệm và lòng trắng trứng thích hợp để trích ly Lysozyme.
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố (tỷ lệ pha loãng) với 5 mức độ và lặp lại 3 lần.
Tiến hành thí nghiệm:
+ Sử dụng loại trứng gà được xác định ở thí nghiệm 1.
+ Lấy lòng trắng trứng (3 trứng có khối lượng và kích thước) pha loãng với dung dịch được xác định ở thí nghiệm 2.
+ Tỷ lệ lòng trắng trứng và dung dịch đệm lần lượt là 1 : 0, 1 : 0,5, 1 : 1, 1 : 2, 1 : 4 ở nhiệt độ 40C trong 10 phút.
Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5
Dung dịch Nước cất
Đệm phosphate 0,1M pH 5
Đệm phosphate 0,1M pH 6
Đệm phosphate 0,1M pH 7
Đệm phosphate 0,1M pH 8
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 20 Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Chỉ tiêu đánh giá:
+ Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (Phụ lục 1).
+ Hoạt tính Lysozyme bằng phương pháp Shugar (Phụ lục 1).
+ Hoạt tính đặc hiệu.
+ Hoạt tính tổng.
+ Protein tổng.
3.2.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát nhiệt độ để trích ly Lysozyme Mục đích: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly Lysozyme.
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố (nhiệt độ) với 5 mức độ và 3 lần lặp lại.
Bảng 5: Nhiệt độ trích ly
*NT: Nghiệm thức
Tiến hành thí nghiệm:
+ Sử dụng loại trứng gà được xác định ở thí nghiệm 1.
+ Lấy lòng trắng trứng (3 trứng có khối lượng và kích thước) pha loãng với từng loại dung dịch được xác định ở thí nghiệm 2.
+ Tỷ lệ pha loãng giữa đệm và lòng trắng trứng được xác định ở thí nghiệm 3 và trích ly ở nhiệt độ theo bảng 5 trong thời gian 10 phút.
- Chỉ tiêu đánh giá:
+ Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (Phụ lục 1).
+ Hoạt tính Lysozyme bằng phương pháp Shugar (Phụ lục 1).
+ Hoạt tính đặc hiệu.
+ Hoạt tính tổng.
+ Protein tổng.
Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5
Nhiệt độ (0C) 4 30 40 50 60
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 21 Viện NC & PT Công nghệ sinh học
3.2.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian để trích ly Lysozyme Mục đích: Xác định thời gian thích hợp để trích ly Lysozyme.
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố (thời gian) với 6 mức độ, 3 lần lặp lại.
Bảng 6: Thời gian trích ly
Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6
Thời gian trích ly
(phút) 5 10 15 20 25 30
*NT: Nghiệm thức
Tiến hành thí nghiệm:
+ Sử dụng loại trứng gà được xác định ở thí nghiệm 1.
+ Lấy lòng trắng trứng (3 trứng có khối lượng và kích thước) pha loãng với từng loại dung dịch đệm được xác định ở thí nghiệm 2.
+ Tỷ lệ pha loãng giữa đệm và lòng trắng trứng được xác định ở thí nghiệm 3 và trích ly ở nhiệt độ được xác định ở thí nghiệm 4 trong thời gian theo bảng 6.
Chỉ tiêu đánh giá:
+ Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (Phụ lục 1).
+ Hoạt tính Lysozyme bằng phương pháp Shugar (Phụ lục 1).
+ Hoạt tính đặc hiệu.
+ Hoạt tính tổng.
+ Protein tổng.
+ Điện di dịch trích lòng trắng trứng bằng phương pháp điện di SDS-PAGE (Phụ lục 1).
3.2.2. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và xử lý thống kê bằng phần mềm STATGRAPHICS Centurion XV.1.2.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 22 Viện NC & PT Công nghệ sinh học
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN