7. Ngộ độc Ciguatera (CFP)
7.2.3 Các xét nghiệm sinh hóa
Phương pháp xác định độc tố sinh học biển lý tưởng đòi hỏi sự đơn giản, độ nhạy và tính đặc hiệu cao. Chính vì vậy, hướng đánh giá lựa chọn các phương pháp xác định độc tố sinh học biển nghiêng về các phân tích miễn dịch học (Hokama và Smith, 1990). Các phương pháp hóa miễn dịch đã được phát triển trong hướng nghiên cứu này ví dụ như phương pháp miễn dịch đánh dấu phóng xạ
268
(RIA) (Hokama và cs., 1977), phương pháp miễn dịch enzyme cạnh tranh, và que thử nhanh miễn dịch enzyme (Hokama, 1985; Hokama và cộng sự, 1985, 1987).
Tuy nhiên các phương pháp hóa miễn dịch này lại có nhược điểm do khả năng phản ứng chéo với các hợp chất polyete khác và do nguồn cung cấp kháng thể bị giới hạn.
Sự xuất hiện của các loài khác trong họ ciguatoxins ở khu vực Ca ri be là những chỉ số quan trọng trong việc xác định loài cá có chứa ciguatera. Các phương pháp định lượng kháng thể dựa trên mức kháng thể tăng lên phản ứng lại độc tố P- CTX-1 hoặc các phân đoạn của P-CTX được cho là không thích hợp để xác định các độc tố ciguatera ở vùng Ca ri be (Vernoux và Lewis, 1997).
Phương pháp miễn dịch đánh dấu phóng xạ (RIA)
Vào năm 1977, một kỹ thuật miễn dịch đánh dấu phóng xạ đã được phát triển để xác định độc tố ciguatoxin trong các mẫu cá đã bị nhiễm độc (Hokama và cộng sự, 1977). Trong phương pháp này, CTX ghép cặp với albumin trong huyết thanh người được tiêm vào cừu và thỏ để sản sinh ra kháng thể. Kháng thể từ cừu với CTX được sử dụng trong phương pháp RIA sau khi tinh sạch và kết hợp với I2. Thực tế vẫn có một số kết quả dương tính giả được phát hiện khi áp dụng phương pháp này. Ngoài ra, phương pháp này không thể áp dụng khi phân tích cá với khối lượng mẫu lớn.
Phép thử hấp thu miễn dịch gắn kết enzyme ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Hiệu quả thực sự trong việc xác định độc tố đã được cải thiện nhờ nghiên cứu ứng dụng phương pháp miễn dịch enzyme thực hiện bởi Hokama và cộng sự.
Quy trình xác định được xây dựng trên cơ sở phối hợp enzyme peroxidaza liên hợp chiết từ cây cải ngựa có khả năng kháng độc tố ciguatoxin thí nghiệm trên cừu và đo hệ số hấp phụ màu sinh ra từ phản ứng enzyme. Phương pháp này có độ chính xác tương tự các phương pháp RIA đã ứng dụng trước đây nhưng chi phí thấp hơn và có ý nghĩa thực tế hơn. Tuy nhiên, do cách thức tiến hành khá phức tạp nên phương pháp này ít được áp dụng trong phân tích độc tố.
Phương pháp ứng dụng que thử nhanh
Nhằm rút ngắn thời gian xác định độc tố, Hokama (1985) đã đơn giản hóa quy trình ứng dụng enzyme bằng cách phủ lớp dung dịch bám dính vào những chiếc que thử làm bằng tre. Các que thử này chỉ cần xiên vào cơ thịt cá và sau khi cơ thịt cá dính vào lớp dung dịch phủ trên que thì chúng sẽ được trộn lẫn với hỗn hợp thuốc thử. Phương pháp này được chứng minh là có hiệu quả thực sự trong việc phân biệt các loài cá có chứa độc tố và các loài cá không chứa độc tố. Tuy nhiên, trong các trường hợp mẫu thử khó xác định hoặc kết quả của phép thử trên cá nằm gần ranh giới giữa có và không có độc tố ciguatoxin thì để có được kết quả chính xác cần lặp lại phép thử tới sáu lần trên một mẫu cá.
269
Tóm lại đây là một phép thử nhanh thông qua nhận biết màu sắc bằng mắt thường đạt được nhờ việc phủ lớp kháng thể sinh ra từ cừu phản ứng lại với độc tố ciguatoxin kết hợp với enzyme peroxidaza từ cây cải ngựa. Khoảng 10 phút sau khi ủ, dựa vào sự thay đổi màu sắc của que thử thay đổi từ không màu tới hoàn toàn xanh tím để nhận biết mẫu thử từ mức không chứa độc tố cho tới hàm lượng độc tố rất cao. (Hokama và cộng sự, 1987). Sau đó, Hawaii Chemtect International (ciguateact±) đã phát triển phương pháp miễn dịch enzyme triển khai thành dạng que thử nhanh (cho kết quả trong vòng 15 phút) dựa trên kháng thể kháng độc tố ciguatera tiết ra từ cừu và gắn với enzyme peroxidaza từ cây cải ngựa để xác định các độc tố ciguatera gắn liền với nhóm độc tố gây tiêu chảy. Phương pháp thử Ciguatect± này cũng có thể sử dụng như một phép đo định tính để chọn lựa các mẫu cho các phân tích định lượng tiếp theo. Sự sàng lọc này là hữu hiệu khi mà việc xác định phản ứng chéo tương đối của vô số các dẫn xuất trong quá trình định tính ciguatoxin còn hạn chế do thiếu các mẫu độc tố ciguatoxin chuẩn. Tuy nhiên, vẫn chưa xác định được tỉ lệ của các phản ứng dương tính giả trong phép thử này.
Phương pháp Ciguatect± cũng được lên kế hoạch đưa vào nghiên cứu của nhóm Nghiên cứu Hợp tác Toàn cầu của AOAC. Tuy nhiên, cho tới nay, nghiên cứu này vẫn chưa hoàn thiện bởi các kháng thể ở đây không thuộc nhóm kháng thể đơn dòng, do đó còn nhiều nghi ngờ về độ ổn định và giá trị sử dụng lâu dài cần thiết cho sự phát triển và hiệu lực áp dụng của phương pháp này. Các nhóm nghiên cứu cũng đang phát triển các dòng tế bào lai mới để sản xuất kháng thể đơn dòng kháng ciguatoxin (Quilliam, 1998 a, 1999).
Các xét nghiệm miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng
Tất cả các nghiên cứu ban đầu thực hiện trên kháng thể đa dòng gắn với độc tố ciguatoxin ở cừu. Hạn chế của phương pháp này là để sản xuất kháng thể trong thời gian dài đảm bảo đủ cho việc trích bồi thì cần một nguồn cung cấp kháng nguyên đều đặn. Trái lại, các kháng thể đơn dòng có thể cung cấp thường xuyên một loại kháng thể được lựa chọn nào đó. Hokama và cộng sự (1985, 1989a) và Hokama (1990) đã báo cáo quy trình sản xuất các kháng thể đơn dòng của ciguatoxin (thường là CTX-1) và độc tố cùng nhóm polyete.
Công nghệ sử dụng các kháng thể đơn dòng đã góp phần cải thiện quy trình thử nhanh về mặt tốc độ phát hiện, ứng dụng thực tế và tính đặc hiệu của phương pháp (Hokama và cộng sự, 1989b). Trong phương pháp này, CTX đã được tiếp hợp với albumin huyết thanh người với carbon imide, và chuột chứa chuỗi di thể BALB/c đã được tiêm với hỗn hợp liên hợp trên. Các tế bào ung thư tủy ở chuột tổng hợp globulin không có khả năng miễn dịch được sử dụng để kết hợp với PBX63-Ag8ã65B theo bố trớ sẵn tương tự như cỏc nghiờn cứu trước đõy (Hokama và cộng sự, 1989a). Do đó, phương pháp miễn dịch enzym áp dụng trong que thử nhanh thực ra vẫn tuân thủ nguyên lý theo thiết kế ban đầu (Hokama và cộng sự, 1987), chỉ khác ở chỗ các enzym peroxidaza trong trường hợp này được liên hợp với các kháng thể đơn dòng kháng CTX (MAB-CTX). Phương pháp này hiện
270
được mở rộng áp dụng trong các nghiên cứu và xác nhận các chuẩn đoán lâm sàng.
Phương pháp miễn dịch pha rắn
Vào năm 1990, phương pháp miễn dịch pha rắn (SPIA), trong đó các hạt polystyrene mang màu được phủ sẵn lớp MAB-CTX, đã được đưa vào sử dụng để xác định trực tiếp CTX hút bám trên các kẽ tăm đã gắn sẵn dung dịch phủ hữu cơ (Hokama, 1990; Hokama và cộng sự, 1993). Phương pháp miễn dịch màng được công bố bởi Hokama và cộng sự (1998) dựa trên nguyên lý về miễn dịch học được phát triển từ phương pháp SPIA thông qua việc sử dụng một loại kháng thể đơn dòng kháng lại cá chình Moray đã được tinh chế (MAB-CTX) bao phủ bởi lớp hạt polystyrene nhuộm màu. Các độc tố nhóm polyete được chiết từ cơ thịt cá liên kết với lớp màng polyvinyl kị nước phủ trên một lớp nhựa (que thử gắn lớp màng) và được xác định bởi MAB-CTX bọc ngoài các hạt polystyrene nhuộm màu. Cường độ màu sắc của lớp màng gắn trên que thử tỉ lệ với nồng độ độc tố CTX trong dịch chiết của dung môi methanol. Tóm lại, phương pháp MIA cho thấy khả năng xác định CTX ở khoảng cho phép (xấp xỉ 0,032 ng CTX/g mẫu). Trong quá trình cải thiện phương pháp MIA nhằm đặt được kết quả chính xác và độ lặp lại cao đã có sự thay đổi nhiều nhân tố quan trọng, cụ thể như sau: một là, tránh việc chạm vào lớp màng sau khi đã gắn lên que thử để tránh xảy ra các phản ứng dương giả; hai là, thời gian ngâm que thử đã phủ màng trong hỗn hợp mẫu cá và methanol ít nhất là 20 phút để thu được kết quả tối ưu; ba là, qua thử và ống chứa thuốc thử phải được làm khô hoàn toàn trước khi đổ hỗn hợp dịch nhày miễn dịch vào trong ống thử; và bốn là que thử chứa thành phần màng không được ngâm trong dung dịch chất miễn dịch quá 10 phút. Phương pháp này của Hokama và cộng sự (1998) đã được đưa ra để bàn luận trong nhóm nghiên cứu cộng tác về các phương pháp bán định lượng của tổ chức Quốc tế AOAC vào năm 1999 (Hokama và Ebesu, 2000).
Các thành viên của nhóm nghiên cứu này đã nhận được những mẫu cá khô tương đồng hoặc không tương đồng với dịch chiết tiêu chuẩn có chứa CTX. Nghiên cứu này vẫn đang trong tiến trình đánh giá để phù hợp với các tiêu chí của Tổ chức các nhà phân tích chính thức AOAC về các độc tố có nguồn gốc tự nhiên. Hiện nay, kết quả đánh giá ban đầu đã được khẳng định thông qua độ nhạy (được định nghĩa là tỉ lệ giữa phần trăm các mẫu dương tính được phát hiện bởi phương pháp và phần trăm các mẫu dương tính thực sự được biết tới trong mẫu) và tính đặc hiệu (được định nghĩa như là tỉ lệ của các mẫu âm tính thực sự cũng sẽ được phát hiện là âm tính nhờ xác định bởi phương pháp này) lần lượt là 91% và 87%.