7. Ngộ độc Ciguatera (CFP)
7.2.4 Các phương pháp hóa học
Các độc tố thuộc nhóm ciguatoxin không thể hiện màu sắc rõ nét khi xác định bằng phương pháp quang phổ trong các thí nghiệm nhưng lại chứa nhóm hydroxyl sơ cấp tương đối phản ứng nên sau khi được xử lý thích hợp có thể dùng
271
làm mẫu để đem đi phân tích sắc ký. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (LC) với đầu dò huỳnh quang có thể áp dụng cho kết quả phân tích chính xác đang là chọn lựa tiềm năng trong việc xác định hàm lượng ciguatoxins tự nhiên trong dịch chiết từ cơ thịt cá. Dickey và cộng sự (1992b) và Yasumoto và cộng sự (1993) đã báo cáo những kết quả đầy triển vọng thông qua việc đánh dấu ciguatoxin bằng thuốc thử huỳnh quang trên nền tảng cumarin theo phương pháp truyền thống hoặc thuốc thử fluorescent 1-anthroylnitrile trước khi tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và đầu dò huỳnh quang. LC kết hợp với phương pháp khối phổ phun ion và kiểm soát ion lựa chọn (MS) đang là một phương pháp thay thế cho việc sử dụng đầu dò huỳnh quang xác định ciguatoxin. Phương pháp này được xem như một thử nghiệm khả thi trong việc xác định các độc tố gây tiêu chảy được đánh dấu (Pleasance và cộng sự, 1992b). Những nghiên cứu sơ bộ về CTX-1 chỉ ra rằng phương pháp này có thể làm nền tảng cho phép thử xác nhận trong xác định độc tố ciguatera trong cá (Lewis và cộng sự, 1994).
Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)/khối phổ (MS)
NMR và MS là các kỹ thuật dùng để phân tích ciguatoxins trong nội tạng cá (Murata và cộng sự, 1990; Lewis và cộng sự, 1991) và trong cơ thịt cá (Lewis và Sellin, 1992) đồng thời để phân tích cả các độc tố gambiertoxins (tiền độc tố của ciguatoxins) trong dịch chiết chứa G. toxicus tự nhiên và được nuôi cấy (Murata và cộng sự, 1990; Satake và cộng sự, 1993).
Các phương pháp NMR và MS hiện hành để phân tích ciguatoxins tiến hành quá trình chiết rút độc tố ciguatoxin ở nồng độ thấp trên quy mô lớn trong những loài cá có độc tính cao nhưng lại không xác định được đặc tính của ciguatoxin ở nồng độ thấp hơn 0,1 nmol/kg. Lewis và Jones (1997) đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng pha đảo gradient /khối phổ nhằm xác định ciguatoxins tích lũy trong cá. Phân tích được tiến hành với 5 mg mẫu là cá chình biển có độc tính cao đã được tinh sạch sơ bộ đánh bắt tại khu vực Thái Bình Dương. P-CTX-1, một loại độc tố chính trong cơ thịt và nội tạng của loài cá ăn thịt chứa ciguatera ở khu vực Thái Bình Dương, đã được sử dụng làm độc tố chỉ thị trong nghiên cứu này. Phương pháp này cho kết quả nhạy hơn, đặc hiệu hơn so với phương pháp sinh học trên chuột và đã xác định được 11 dẫn xuất của P-CTX trong một mẫu được làm giàu từ nội tạng cá chình Moray. Mối nguy và nguồn gốc của các dẫn xuất này vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu.
Phương pháp khối phổ
Lewis và cộng sự (1999) đã công bố bài báo về việc ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ ion hóa bằng phun điện tử khối phổ (LC-ESI-MS/MS) hiện đại nhất với những diễn giải rất thực tế trong việc phát hiện và xác định ciguatoxins.
Phương pháp này có thể xác định độc tố trong cơ thịt cá ở nồng độ tương ứng khoảng 40 ng/kg P-CTX-1 và 100 ng/kg C-CTX-1.
272
Phương pháp điện di mao quản vùng
Bouaicha và cộng sự (1997b) đã phát triển một phương pháp trên cơ sở kỹ thuật điện di mao quản vùng (CZE) với đầu dò UV để xác định maitotoxin (MTX) (xem chương 7.3.1), một độc tố gắn liền với mối nguy ngộ độc ciguatoxin từ cá.
Các tác giả đã chứng minh tính khả thi trong việc ứng dụng CZE để tách MTX một cách nhanh chóng và có độ phân giải cao từ một dung dịch chuẩn thương mại (không phải dung dịch tinh khiết). Tập thể các tác giả đã báo cáo kết quả cho thấy hàm lượng độc tố ở mức 50 pg cũng đã có thể quan sát được trên điện di đồ với khả năng hấp thụ UV ở bước sóng 195 nm. Các nhà nghiên cứu đã kết luận rằng CZE là một giải pháp đầy hứa hẹn có thể thay thế các kỹ thuật xác định MTX trong thực phẩm hiện hành như sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS). Mặc dù vậy, phương pháp tách pha rắn vẫn được coi là một kỹ thuật cần thiết trong việc tách chiết chất độc từ cá bởi vì hàm lượng độc tố trong các loài cá có ciguatera thường ở mức giá trị ng/kg.
7.3 Nguồn gốc, môi trường sống và sự phân bố 7.3.1 Nguồn gốc
Tảo Gambierdius toxicus là nguồn sản sinh ra hai nhóm độc tố biển là nhóm độc tố maitotoxins (MTXs) có thể hòa tan trong nước và nhóm độc tố ciguatera hòa tan trong chất béo. Theo những kiểm chứng cho đến nay, tất cả các loài thuộc nhóm tảo Gambierdius toxicus đều có khả năng sản sinh ra MTXs, nhưng mỗi loài dường như chỉ sinh ra một loại MTX. Về cơ bản, nhóm độc tố MTXs được tìm thấy trong ruột của các loài cá ăn thực vật và chưa được chứng minh liên quan tới sự trúng độc ciguatera. Mặt khác, các độc tố ciguatera do một số loài của nhóm tảo G. toxicus sinh ra được tìm thấy trong gan, cơ, da và xương của những loài cá ăn thịt lớn mới là nguyên nhân chính của ngộ độc ciguatera ở người (Chinain và cộng sự, 1999; Lehane và Lewis, 2000).
Nhóm tảo biển Gambierdiscus toxicus được phát hiện vào cuối thập kỉ 70 gần khu vực đảo Gambier. Loại tảo này sống biểu sinh với các khóm tảo đỏ, nâu và xanh cũng như các đá ngầm san hô và trầm tích đáy đại dương (Hallegraeff và cộng sự, 1995). Các loài cá ăn thực vật ăn nguồn san hô chết và tảo biển này thuộc khu vực đá ngầm nhiệt đới và cận nhiệt đới. Do đó độc tố trong các loài tảo biển được tích tụ lại trong các loài cá nói trên. Sau đó, các loài cá ăn thực vật lại trở thành mồi cho các loài cá ăn thịt. Như vậy, thông qua chuỗi thức ăn đã có sự chuyển hóa sinh học từ các độc tố gambiertoxins có tính oxi hóa yếu thành các ciguatera có mức oxi hóa và độc tính mạnh hơn (Durborow, 1999; Lehane và Lewis, 2000). Quá trình chuyển hóa sinh học của các độc tố gambiertoxins thành dạng độc tố ciguatera trong dạ dày của các loài cá ăn thực vật chưa được hoàn tất.
Sau khi được tích lũy trong các loài cá ăn thực vật, các độc tố tiếp tục được hấp thu bởi các loài cá ăn thịt. Trong các loài cá ăn thịt thì các độc tố gambiertoxin được chuyển đổi hoàn toàn thành các độc tố ciguatera, do đó không có sự tồn tại
273
của các độc tố gambiertoxin trong các loài cá này (Burgess và Shaw, 2001). Các loài tảo sống ở tầng đáy thuộc khu vực Purerto cũng được coi là nguồn gốc hình thành độc tố ciguatera (Tosteson và cộng sự, 1998). Trong một số tài liệu, các nhóm tảo khác cũng được xác định là nguồn sản sinh ra độc tố có liên quan tới sự trúng độc ciguatera ví dụ như Prorocentrum concavum, P. mexicanum, P.
rhathytum, Gymnodinium sangieneum và Gonyaulax polyedra (Aseada, 2001).
Các độc tố ciguatera vùng Caribbean (C-CTXs) và Thái Bình Dương (P- CTXs) có cấu trúc liên quan chặt chẽ với nhau nhưng có thể phân biệt nhờ sắc kí.
Các kết quả sắc kí chỉ ra rằng các độc tố thuộc vùng biển Ca ri bê thuộc một họ khác biệt so với độc tố ciguatera. Sự khác nhau của các họ độc tố chính là cơ sở gây nên sự khác nhau trong các đặc điểm của ciguatera được tìm thấy ở các khu vực Thái Bình Dương và Ca ri bê. Cụ thể là các độc tố ciguatera Ca ri bê hình thành từ một số các chất tiền độc tố, tương tự như ciguatera khu vực Thái Bình Dương nơi mà một gambiertoxin (GTX-4A) sinh ra ít nhất bốn loại độc tố ciguatera tích tụ trong cá. Các loại độc tố G. toxicus khác nhau có thể hình thành nên nhiều nhóm độc tố polyete khác nhau và một loại độc tố G. toxicus thuộc vùng Ca ri bê được cho là một nguồn của C-CTX-1 và -2 (De Fouwet và cộng sự, 2001).
7.3.2 Các điều kiện ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng
Tảo G. toxicus đang phát triển và phân bố quanh khu vực nhiệt đới trong khoảng 32 độ Bắc và 32 độ Nam. Nó phát triển tốt ở các lưu vực nước cạn nhằm tránh ảnh hưởng của động vật trên cạn, vùng nước mặn đại dương được cho là khu vực đặc hữu nhất cho sự phát triển của ciguatera (De Fouw và cộng sự, 2001 ). Độ mặn thấp và cường độ ánh sáng cao gây ra những ảnh hưởng bất lợi cho sự tăng trưởng của G. toxicus. Nghiên cứu trên quần thể tảo G. toxicus tại Florida Keys cho thấy G. toxicus tương thích ở độ sâu từ 1 đến 4 m, mạnh nhất ở mức 11 phần trăm của nguồn sáng đầy đủ và đặc biệt thích hợp nhất xảy ra ở nhiệt độ nước khoảng 30oC (Lehane và Lewis, 2000 ). G. toxicus thường được tìm thấy phổ biến như là thực vật biểu sinh trong khu vực rạn san hô nơi có các loài tảo lớn đã bị mất màu như Turbinaria ornata, Amphiroa spp., Halimeda opuntia và Jania spp. (De Fouw và cộng sự, 2001).
Những nghiên cứu về môi trường đưa ra giả thuyết rằng sự phát triển của tảo G. toxicus tăng lên nhờ phơi nắng (tiếp xúc với ánh sáng mặt trời), với sự có mặt của silicat và oxit từ tạp chất trong đất, và các mảnh vụn tảo của các loài cụ thể như Turbinaria, Jania và Amphiroa. Mật độ phát triển của tảo G. toxicus không đều và có thể tăng hoặc giảm khác thường. Các mô hình tăng trưởng này có lẽ là nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi địa điểm và thời điểm bùng phát ngộ độc ciguatera. Tuy nhiên, một điều ít được biết đến là các điều kiện môi trường tương thích có thể thức đẩy sự sinh trưởng của tảo gambiertoxin trong tự nhiên (De Fouw và cộng sự, 2001). Ở khu vực Puerto Rico, độc tính của tảo đáy Ostreopsis
274
lenticularis trong khoảng từ tháng mười tới tháng mười hai là cực đại nếu trước đó (tháng tám tới tháng chín) cần có sự kích thích bởi nhiệt độ bề mặt biển cao trong thời gian dài (trung bình là 20 ngày). Cá nhồng Spyraenea đánh bắt ở khu vực này trong tháng mười tới tháng mười hai cho thấy độc tính cực đại kéo dài trong 24 ngày nếu trong những tháng trước (tháng tám-tháng mười) nhiệt độ trên bề mặt biển cao. Nhiều yếu tố có giải thích cho mối tương quan giữa nhiệt độ bề mặt biển tăng và độc tính ciguatera trong cá. Sự thay đổi hai hoặc ba độ của nhiệt độ môi trường xung quanh có thể dẫn tới sự hình thành các phản ứng đáng kể trong khả năng trao đổi chất và hô hấp, xoay vòng của các hormone và các hoạt động săn mồi của nhiều loài cá (Tosteson và cộng sự, 1998).
Từ tháng hai 1993 đến tháng năm 1997, mật độ sinh trưởng của loài Gambierdiscus. spp trong khu vực French Polynesia Papara đã được giám sát mỗi tuần trong mối liên hệ với nhiệt độ và độ mặn. Tổng số 58 khóm tảo đã hình thành chiếm khoảng 65% chỉ trong năm 1995 và 1996. Mùa vụ theo mật độ tế bào đã được tìm thấy là từ tháng 2 năm 1993 đến tháng 5 năm 1995. Trong thời gian này mật độ tảo Gambierdiscus spp. có xu hướng đạt tới sự phát triển tối đa vào đầu và cuối mùa nóng. Ngược lại, độ mặn không phải là nhân tố quyết định sự phụ thuộc vào mùa vụ của loại tảo này. Sự gia tăng đáng kể trong cả mật độ và tần suất phát triển tối đa của các khóm tảo đã gây chú ý hơn nữa trong năm 1995 và 1996 bởi nhiệt độ nước cao bất thường từ tháng giêng đến tháng tư năm 1994, đồng thời với một dải san hô bị tẩy trắng nghiêm trọng. Sự phân chia độc tính cho thấy độc tố được hình thành tối đa từ tháng 10 năm 1994 tới tháng 12 năm 1996 và không tìm thấy mối tương quan giữa độc tính của các khóm tảo và sinh khối của chúng, cũng như sự thay đổi của nhiệt độ theo mùa (Chinain và cộng sự, 1999).
Lehane (2000) khẳng định rằng không thể đoán biết được sự tồn tại của tảo G. toxicus và sự phát triển mạnh mẽ của nó chưa phải là yếu tố chắc chắn về khả năng hình thành độc tố gambiertoxins. Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng một số vi khuẩn sống cộng sinh với các loài tảo đóng vai trò quan trọng trong việc phát sinh độc tố của những loài tảo này. Những loại vi khuẩn này được cho là có khả năng sản sinh ra các chất dinh dưỡng cho quá trình đồng hóa và cần thiết để hình thành độc tố trong tảo. Một giải thích khác cho rằng vi khuẩn đóng vai trò tổng hợp nên các độc tố và sau đó các độc tố này trở thành thức ăn cho các loài tảo ăn theo lối thực bào (Lehane, 2000).
Trong những thập kỷ qua, các bằng chứng đã chỉ ra rằng sự biến động của các rạn san hô bởi quân đội và sự phát triển du lịch làm đã tăng nguy cơ ngộ độc Ciguatera bằng cách tăng chất nền cho sự phát triển của tảo (Hallegraeff và cộng sự, 1995). Mặc dù có vẻ như không có biến động theo mùa đối với trường hợp ngộ độc Ciguatera, theo một số tác giả thì tần suất của nhồng bị ngộ độc Ciguatera bắt được lại đa dạng theo mùa, với giá trị cao điểm (60-70% cá độc) trong đầu mùa đông- cuối mùa xuân (tháng1 – tháng 5) và mùa thu (tháng tám-tháng mười một).
Tần số tối thiểu (0-10% cá độc) đã được quan sát thấy trong mùa hè (tháng Sáu và
275
tháng Bảy) và tháng mười hai. Các biến thể theo mùa trong ngộ độc ciguatera ở nhồng có thể phản ánh những biến đổi trong độc tính ở con mồi trực tiếp của chúng, cũng như khả năng của hệ thống giải độc của chúng (cơ chế giải độc bị ức chế bởi kích thích tố sản xuất trong chu kỳ sinh sản, và khi nhiệt độ suy giảm) (De Fouw và cộng sự, 2001).
7.3.3 Môi trường sống
G. toxicus phân bố ở khu vực nhiệt đới trong khoảng 32 độ Bắc và 32 độ Nam, và do đó ciguatera cũng gần như tập trung chủ yếu trong các khu vực biển Thái Bình Dương, phía Tây Ấn Độ và vùng biển Ca-ri-be (Lewis, 2000).
7.4. Sự phân bố và tích lũy trong thủy sản
7.4.1 Quá trình hấp thu và đào thải độc tố CFP trong các thủy sinh vật Sự hấp thu và phân bố các độc tố ciguatoxin được nghiên cứu thử nghiệm trên cá ở khu vực Ca-ri-be đánh bắt trong các năm từ 1980 tới 1983 tại hòn đảo St.
Barthelemy (Biển Ca-ri-be). Dịch chiết lipit từ nhiều cơ quan khác nhau của các mẫu cá này đã được phân tích bằng thử nghiệm sinh học trên chuột. Các loại cá đem thí nghiệm thuộc các họ Muraenidae, Serranidae, Scombridae, Carangidae, và Sphyraedinae. Hàm lượng ciguatoxin được tìm thấy cao nhất trong nội tạng, cụ thể là trong gan, lá lách, thận và thấp nhất là trong xương. Tỉ lệ nồng độ độc tố trong gan và thận so với cơ thịt chênh lệch rất nhiều và thay đổi theo loài. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy rằng độc tố này phân bố khác nhau trong các loài cá khác nhau. Từ thực tế rằng ở các cơ quan có nhiều mạch máu như gan, lá lách, và thận thì nồng độ độc tố ciguatoxin trên một đơn vị khối lượng là cao nhất đưa ra giả thiết rằng máu tham gia vào quá trình vận chuyển độc tố ciguatoxin tới các mô chất khác (De Fouw và cộng sự, 2001; Pottier và cộng sự, 2001).
Khi độc tố đi vào cơ thể cá theo đường hấp thụ thức ăn, nồng độ của ciguatoxin tăng lên trong quá trình tiêu hóa thức ăn và nồng độ của nó trong nội tạng, gan và tuyến sinh dục của có thể gấp 50 tới 100 lần so với nồng độ độc tố tại các cơ quan khác. Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn chưa giải thích được tại sao cá không có biểu hiện trúng độc sau khi tiêu hóa thức ăn chứa độc tố và bằng cách nào cá bị nhiễm độc có thể lưu trữ chất độc trong cơ thể qua nhiều năm (De Fouw và cộng sự, 2001).
Độc tố tách chiết từ mô cá đuôi gai ăn thực vật (Ctenochaetus striatus) tại vùng Great Barrier Reef đã được phân tích bằng hai phương pháp là phương pháp sinh học thử nghiệm trên chuột và phương pháp sắc ký. Độc tố tồn tại trong mảnh vụn thức ăn (từ nguồn tảo độc) của cá được phân tích và so sánh với thành phần độc tố trong C. striatus. Kết quả cho thấy rằng hàm lượng độc tố gambiertoxins do cá ăn vào thường cao hơn hàm lượng tìm thấy trong gan. Như vậy, quá trình tích lũy độc tố gambiertoxins và sản phẩm chuyển hóa của nó là ciguatoxins theo những cách thức không hề đơn giản, dẫn tới giả thuyết rằng quá trình lọc trong của