Thẩm định quy trình phân tích

Quy trình phân tích hay cũng còn gọi là quy trình thử nghiệm (test procedures) là sự mô tả chi tiết các bước cần thiết để thực hiện một thử nghiệm phân tích (analytical test), bao gồm từ việc chuẩn bị mẫu thử, mẫu chuẩn và các thuốc thử, việc sử dụng các trang thiết bị, việc xây dựng đường cong chuẩn độ, cho đến việc sử dụng công thức để tính toán và biện giải kết quả, v.v…[5]

Thông thường có 4 loại quy trình phân tích được thẩm định [3, 5]:

- Quy trình định tính (identification test)

- Quy trình định lượng tạp chất (quantitative tests for impurities’ content) - Quy trình thử giới hạn tạp chất (limit test for the control of impurities) - Quy trình định lượng (quantitative tests of the active moiety or other components).

Quy trình định lượng là quy trình nhằm đo lường chất cần thử trong mẫu thử. Đối với chế phẩm, thử định lượng nhằm xác định hàm lượng của các hoạt chất có trong mẫu chế phẩm đem thử [5].

Thẩm định quy trình phân tích là một quá trình thực hiện thiết lập các thông số đặc trưng của phương pháp để cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Nói cách khác kết quả của việc thẩm định một quy trình phân tích có thể chứng minh một cách khoa học rằng các sai số mắc phải của quy trình thử nghiệm là rất nhỏ và chấp nhận được, nhằm đảm bảo quy trình phù hợp và kết quả phân tích đạt độ tin cậy trong suốt quá trình phân tích. [3, 5].

Theo ISO/IEC 17025 – tiêu chuẩn về hệ thống quản lý chất lượng áp dụng chuyên biệt cho phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn, do Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế International Organization for Standardization (thường gọi tắt là ISO) phát triển và ban hành, phương pháp phân tích phải được thẩm định hoặc thẩm định lại khi [3]:

- Phương pháp áp dụng không phải là phương pháp tiêu chuẩn

(nonstandard method)

- Phương pháp do phòng thử nghiệm tự xây dựng mới trước khi đưa vào sử dụng thành thường quy

- Có sự thay đổi về đối tượng áp dụng nằm ngoài đối tượng áp dụng của phương pháp đã thẩm định hoặc phương pháp tiêu chuẩn

- Có sự thay đổi các điều kiện thực hiện phương pháp đã được thẩm định (ví dụ: thiết bị phân tích với các đặc tính khác biệt, nền mẫu, người phân tích…).

Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương pháp” (Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH (International Conference on Harmonization) ban hành vào tháng 11 năm 2005 [33], các yếu tố của một quy trình phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và miền giá trị. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng không bắt buộc phải có trong quy trình thẩm định.

1.4.1. Tính đặc hiệu Khái niệm

Tính đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác (tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất,…) có trong mẫu thử. Nếu sử dụng kỹ thuật HPLC với đầu dò DAD và/hoặc khối phổ, việc sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh nhầm lẫn các hợp chất khác trong mẫu có cấu trúc tương tự với hợp chất cần định lượng và có lợi trong việc chứng minh rằng pic sắc ký không phải là pic của hai thành phần trở lên [3, 5].

Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu:

- Sắc ký đồ của mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.

- Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [3, 5, 31, 33].

Phương pháp xác định

Tính đặc hiệu cũng là độ nhiễu của phương pháp. Độ nhiễu càng thấp, tính đặc hiệu càng cao.

Trong phương pháp HPLC với đầu dò DAD hoặc khối phổ, việc sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh nhầm lẫn với các hợp chất có cấu trúc tương tự và chứng minh sắc ký không phải là pic của hai thành phần trở lên.

Khi chế phẩm chưa xác định có sản phẩm phân huỷ hay không thì tự tạo ra mẫu có sản phẩm phân huỷ và so sánh với một mẫu không có sản phẩm phân huỷ.

1.4.2. Độ chính xác Khái niệm

Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện. Độ chính xác cũng còn được coi là mức độ dao động của các kết quả đo lường riêng biệt so với giá trị trung bình [3, 5, 31, 33].

Độ chính xác bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên.

Phương pháp xác định

Độ lặp lại: Biểu thị độ chính xác trong cùng điều kiện tiến hành và trong khoảng thời gian ngắn, cụ thể là việc tiến hành thử nghiệm được thực hiện bởi một người trong cùng một phòng thí nghiệm, trên cùng một thiết bị và trong cùng một thời gian.

Tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá trị của quy trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%.

Độ chính xác trung gian: Biểu thị độ chính xác của quy trình theo các biến số của phòng thí nghiệm tại nhiều ngày khác nhau (độ chính xác liên ngày), với nhiều kiểm nghiệm viên khác nhau và với các trang thiết bị khác nhau…

Tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể để đưa ra những cách thức xác

định phù hợp. Nguyên tắc chung là phân tích nhiều lần, nhiều mẫu với các yếu tố như thời gian, địa điểm, hệ thống máy… thay đổi.

Yêu cầu

Tiêu chuẩn cho giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích mẫu phân tích. Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt trên dưới 2%. Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn. Giá trị RSD càng nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [3, 5].

1.4.3. Độ đúng Khái niệm

Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần giữa giá trị tìm thấy so với giá trị thực thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [3, 5, 31, 33].

Độ đúng bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống.

Phương pháp xác định

Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau).

Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo công thức sau:

Tỷ lệ phục hồi = 𝑋

à ì 100%

Trong đó: 𝑋 là giá trị mẫu đo được à là giỏ trị mẫu theo lý thuyết.

Yêu cầu

Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình xử lý mẫu và nồng độ phân tích. Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [3, 5]. Tỷ lệ phục hồi càng gần giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao.

1.4.4. Tính tuyến tính Khái niệm

Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x).

Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R2 [3, 5, 31, 33].

Phương pháp xác định

- Khoảng tuyến tính cần được khảo sát ở khoảng 10 (ít nhất 5 [5, 33]

hoặc 6 [3, 31]) mức nồng độ khác nhau.

- Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của phương pháp.

- Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu. Khi thẩm định phương pháp, mỗi nồng độ cần được đo vài lần (3 lần [3]) để kiểm tra độ lặp của các nồng độ chuẩn.

- Đánh giá tính tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp:

trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình.

Yêu cầu

Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,90 ≤ R2 ≤ 1 [5].

1.4.5. Miền giá trị Khái niệm

Miền giá trị của một quy trình phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử với bất kì nồng độ nào trong khoảng này đều phải đáp ứng về độ chính xác lẫn độ đúng và tính chất tuyến tính của phương pháp [3, 5, 31, 33].

Miền giá trị thường được biểu thị bằng khoảng nồng độ mà ở khoảng nồng độ này vẫn còn sự phụ thuộc tuyến tính giữa giá trị đo được và nồng độ [3, 5, 31, 33].

Phương pháp xác định

- Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính của một khoảng nồng độ nhất định.

- Sau đó thiết lập bằng cách khẳng định là khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không.

Yêu cầu

Với quy trình định lượng nguyên liệu và thuốc, yêu cầu tối thiểu của miền giá trị là phải đạt 80% – 120% nồng độ của mẫu thử [3, 5, 31, 33].

1.4.6. Giới hạn phát hiện Khái niệm

Giới hạn phát hiện (LOD) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải xác định chính xác hàm lượng [3, 5, 31, 33].

Phương pháp xác định

- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn phát hiện được.

- Phương pháp lập tỷ số tín hiệu phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử:

áp dụng với quy trình có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền.

Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOD là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 – 3.

- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:

LOD = 3,3 × 𝑆𝐷

𝑎

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng

SD: độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường chuẩn định lượng.

1.4.7. Giới hạn định lượng Khái niệm

Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp [3, 5, 31, 33].

Phương pháp xác định

- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác: LOQ được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn định lượng được với độ đúng và độ chính xác chấp nhận được.

- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOQ là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10.

- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:

LOD = 10 × 𝑆𝐷

𝑎

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn độ

SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường cong chuẩn độ

Tối ưu hóa điều kiện sắc ký

Tối ưu hóa điều kiện sắc ký